雄激素受体-核型丛生蛋白信号通路在草酸钙肾结石生成中的作用及机制研究

The incidence of kidney stones is up to 5-10%.Epidemiological studies show a 3-4:1 male-to-female ratio of nephrolithiasis. Apoptosis of renal tubular epithelial cells is the key step in stone formation. Androgen may promote the apoptosis of renal tubular epithelial cells. However, the specific mechanism is still unknown. It was shown in our studies that serum testosterone and androgen receptors (AR) inside the kidney are up regulated in men with calcium oxalate nephrolithiasis. Our further studies showed that clusterin in urine and renal tubular epithelial cells is higher in the patients with nephrolithiasis, compared with the control groups.We found that Androgen promote the renal tubular epithelial cells to produce nCLU, which had been reported be pro-apoptosis. Therefore, we propose following consumptions: promotes the apoptosis of apoptosis of renal tubular epithelial cells through AR-nCLU signaling pathway, and finally promotes the formation ofcalcium oxalate stones. Focused on these questions, we will carry out following researches. (1) The role of nCLU in androgen-related apoptosis; (2) The effect of AR on the expression of nCLU; (3) The regulation mechanism of AR on the nCLU expression; (4) The mechanism of AR's effect in nCLU gathering.Then,detect the expression of the key proteins in the AR- nCLU signaling pathway and evaluate their value as biological parameters of calcium oxalate renal stones. Through these efforts, we hope to provide new ideas for the research of pathogenesis of nephrolithiasis.

肾结石发病率高达5-10%，男性发病为女性3倍。肾小管上皮细胞的凋亡是肾结石形成的关键环节。雄激素可促进肾小管上皮细胞凋亡，但机制不明。我们研究显示：草酸钙肾结石患者血浆中睾酮水平及肾小管上皮细胞雄激素受体（AR）表达均上调；尿液及肾小管上皮细胞中的丛生蛋白(CLU)的水平也明显增高；睾酮可以上调具有促凋亡作用的核型丛生蛋白（nCLU）的表达。因此，我们推测：雄激素通过AR-nCLU信号通路促进肾小管上皮细胞凋亡，从而促进草酸钙结石的生成。本项目拟先从细胞层面探索AR-nCLU信号通路诱导肾小管上皮细胞凋亡的作用及机制：1. nCLU在睾酮诱导细胞凋亡的作用；2. AR对nCLU表达的影响；3.AR影响nCLU表达的机制；4.nCLU介导细胞凋亡的机制。其后，在组织及体液中评估AR-nCLU信号通路关键蛋白作为草酸钙肾结石生物学指标的价值。为肾结石发病机制研究提供了新的理论依据。

肾小管上皮细胞的凋亡是肾结石形成的中心环节。既往研究显示，雄激素可促进肾小管上皮细胞凋亡，但机制不明。我们前期的临床研究显示，草酸钙结石患者体内睾酮及雄激素受体（AR）表达水平升高，肾小管上皮细胞中的丛生蛋白(CLU)的水平也明显增高。本研究中，通过免疫荧光实验（ICC）验证了人肾小管上皮细胞（HK-2）和小鼠肾小管上皮细胞（TCMK-1）中均表达AR。通过慢病毒转染HK-2细胞过表达和干扰AR建立细胞模型，进行基因芯片分析筛选出差异基因，对所找到基因进行功能、通路等分析，并建立蛋白互作网络分析。细胞实验中，探索了睾酮刺激HK-2细胞后丛生蛋白的表达变化。发现睾酮刺激浓度较高时（>10μM）丛生蛋白（CLU）mRNA表达降低，而来自细胞核的核型丛生蛋白（nCLU）mRNA水平差异无统计学意义。而不同条件睾酮刺激下，以及不同培养条件下，分泌型丛生蛋白（sCLU）和核型丛生蛋白（nCLU）在蛋白水平无显著差异变化。临床研究显示，结石患者血液丛生蛋白水平显著低于健康对照组，而两组间尿液丛生蛋白水平无显著差异，多因素分析显示尿液丛生蛋白水平降低是草酸钙结石复发的危险因素。细胞实验显示，睾酮刺激可抑制HK-2细胞的生长、诱导肾小管上皮细胞的凋亡以及坏死，并具有浓度依赖特性。本研究探索了雄激素对于促凋亡蛋白BNIP3的作用，发现睾酮促进BNIP3的表达，并呈剂量依赖性。通过设计BNIP3的siRNA,流式细胞仪检测和TUNEL实验证明BNIP3是睾酮诱导肾小管上皮细胞凋亡和坏死的核心蛋白，并发现该凋亡途径是非依赖caspase的细胞凋亡途径。最后，本研究验证了HIF-1α是binp3基因的上游调控因子。这些研究表明，结石刺激肾小管上皮细胞后，保护性蛋白（CLU）表达降低；睾酮刺激肾小管上皮细胞后，促凋亡的蛋白（BNIP3）表达上调，并通过非依赖caspase的途径诱导细胞凋亡，这些因素促进了肾结石的生成及复发。