AREG-EGFR和钙离子振荡双信号介导的肺泡巨噬细胞-肺泡上皮细胞间免疫通信与ARDS关系的研究

ARDS has a high mortality, making exploring new treatment strategies be an urgent problem in critical care. In our previous study, we found that activated alveolar macrophages not only produce proinflammatory cytokines to initiate inflammation but also excrete AREG to protect alveolar epithelial cells from inflammatory attack. Another great progress in ARDS study is that alveolar macrophages combine with alveolar epithelial cells by gap junctions and that intracellular Ca2+ oscillation signal but not change of total intracellular Ca2+ is responsible for alveolar macrophage-epithelia cell immunity communication. This study is aimed to combine the two progresses to explore the roles of dual signal systems of AREG-EFGR and Ca2+ oscillation to protect alveolar epithelial cells and to explore the mechanism underlying AREG protection. This study will elucidate the mechanisms of AREG (extracellular pathway) and Ca2+ oscillation (intracellular pathway) of activated alveolar macrophages to protect alveolar epithelial cells from inflammatory damage. This study is of important significances: to pave a scientific way to search new strategies of ARDS treatment and to provide more scientific evidences to establish the new concept that alveolar macrophages have protective effect.

ARDS死亡率高，探索ARDS新的治疗策略是危重医学亟待解决的重大问题。我们前期研究发现，活化的肺泡巨噬细胞除分泌促炎因子外，还分泌AREG保护肺泡上皮细胞免受炎症反应的损伤，但作用机制尚不清楚。另一进展发现，肺泡巨噬细胞与肺泡上皮细胞通过缝隙连接而结合在一起，肺泡巨噬细胞通过Ca2+振荡信号而非胞内总Ca2+的变化参与肺泡巨噬细胞-肺泡上皮细胞间免疫通信。本项目拟结合这两方面的进展，利用游离肺温血灌注、肺泡腔微注射技术、原位免疫荧光成像等技术，研究AREG-EGFR和Ca2+振荡双信号系统在肺泡上皮细胞保护中的作用，同时探讨AREG保护肺泡上皮细胞的作用机制。本项目有望揭示肺泡巨噬细胞通过AREG（胞外途径）和Ca2+振荡（胞内途径）双信号系统保护肺泡上皮细胞的机制。本项目的完成将为临床治疗ARDS新策略的找寻提供科学依据，对于肺泡巨噬细胞的免疫调控新途径的揭示具有重要的科学意义。

我们已经发现，巨噬细胞M1型活化分泌双调蛋白来保护肺泡上皮细胞免受炎症损伤。Westphalen发现的是细胞内Ca2+振荡信号系统保护肺泡上皮细胞；我们发现的是细胞外的AREG保护肺泡上皮细胞。我们认为，把细胞外的AREG信号和细胞内Ca2+振荡信号系统结合起来，有可能为找寻ARDS治疗新策略提供科学依据和理论基础。我们通过构建内毒素性ARDS小鼠模型和体外的巨噬细胞培养模型，通过厄洛替尼预处理、CaM-Ca2+亲和力测定、AREG表达分析、肺组织病理评分、免疫荧光、巨噬细胞分泌的AREG和上皮细胞AREG受体相互作用分析，主要探讨了Ca2+振荡在肺泡巨噬细胞-肺泡上皮细胞间免疫通信中的作用和机制。首先我们证实了AREG是巨噬细胞和上皮细胞通过Ca2+震荡信号系统实现免疫通信，通过保护上皮细胞屏障系统发挥肺保护作用，厄洛替尼预处理在内毒素性肺损伤中也发挥肺保护作用。其次，我们认为脑-免疫轴在炎症反应中起着重要作用，与意识的关系密切。钙离子作为机体重要的离子，参与了意识调控。因此增加了Ca2+在意识方面作用的研究内容。我们采用七氟烷使小鼠翻正反射消失的ED50值来测量意识水平，通过向小鼠侧脑室注射2ul 0.9% NaCl、EGTA 7.5 mmol/l, 40CaCl2 50 mmol/L和43CaCl2 50 mmol/L，我们发现侧脑室注射钙离子螯合剂EGTA，降低脑脊液钙离子浓度，增加小鼠七氟醚的翻正反射消失 ED50值，而注射40CaCl2 和43CaCl2，则降低小鼠七氟醚的翻正反射消失 ED50值，且40CaCl2 和43CaCl2对七氟醚使得小鼠失去翻正反射ED50值的影响相同，缺乏钙同位素依赖性。我们发现钙离子增加抑制意识水平，降低钙离子浓度有利于提高意识水平。这部分研究否定了Fisher关于31P核自旋形成量子纠缠来介导意识发生的理论，促进意识的进一步研究。