羊痘病毒毒力因子P32和KLP蛋白与胎羊皮肤细胞相互作用的研究

羊痘病毒（capripoxvirus CaPV）是毒力最强的动物痘病毒，主要侵害羊的皮肤和肺脏，对羔羊的致死率可高达80％。虽然世界各国研制的羊痘病毒弱毒疫苗较好的控制了本病的流行，但因注苗而引起母羊流产等不安全事故时有发生，且其分子病理机制仍不清楚。本研究通过建立我国CaPV疫苗株侵染胎羊皮肤细胞的模型，获得cDNA文库，以CaPV的毒力因子：外膜蛋白P32和Kelch like protein(klp)蛋白基因构建诱饵质粒，采用酵母双杂交技术，筛选、检测由羊痘病毒侵染而引起的胎羊皮肤细胞特异表达的prey蛋白基因，用Q-RT-PCR检测prey蛋白mRNA消长规律，并用免疫共沉淀法验证prey蛋白。筛选出与羊痘病毒P32和klp蛋白作用的胎羊皮肤细胞靶蛋白，为揭示羊痘病毒感染与羔羊发病死亡间的分子作用机制奠定基础，为羊痘病毒更有效疫苗或新药物的研发、羊痘的预防和治疗提供科学依据。

本项目利用酵母双杂交技术,研究了山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55和本地分离的山羊病毒流行株AKS2010的毒力因子蛋白KLP2和膜蛋白质P32分别与其感染的绵羊胎羊皮肤细胞相互作用的靶蛋白的情况。首先，应用分子生物技术克隆了山羊痘病毒疫苗株和流行株的KLP2和P32基因，并将这些基因插入到pGBKT7载体中构建成诱饵质粒。其次，培养绵羊胎羊皮肤原代细胞，培养山羊痘病毒疫苗株和分离流行株，得到山羊痘病毒流行株3株，建立山羊痘病毒感染胎羊皮肤细胞实验模型，用构建了山羊痘病毒感染的胎羊皮肤细胞cDNA酵母文库。最后，分别将携带有诱饵质粒的酵母菌Y187与携带有胎羊皮肤细胞cDNA文库的酵母菌AH109进行配合，筛选阳性菌，提取质粒并测序分析。结果KLP2疫苗株筛选的S100钙结合蛋白A13，多PDZ结构域蛋白，细胞分裂和凋亡调节因子；流行株筛选的靶蛋白有骨髓/淋巴混合血统因子；P32疫苗株筛选的靶蛋白有信号识别颗粒受体，氢离子转发ATP酶，蛋白酶体激活剂亚基；P32流行株筛选的靶蛋白有组氨酸/赖氨酸-N甲基转移酶，N型压敏钙通道亚基，锌指家族中蛋白（HKR1）。并对筛选得到的靶蛋白做了Q-RT-PCR和免疫共沉淀验证，最终7蛋白表达有升高， 3个蛋白免疫共沉淀验证可能是互作蛋白。疫苗株与流行株有一定差别。为进一步揭示羊痘病毒的分子致病机制的奠定基础。