山羊痘病毒毒力因子KLP1互作蛋白筛选及生物学功能研究

Capripoxvirus (CaPV) is an animal pox virus with strongest virulence and linear genome. It includes an core area in the middle parts and an variable area on both sides. KLP1 lies in variable area. it has been proven to have strong pathogenicty. But its bilogical function and pathogenic molecular mechanism are not clear. This study intends to take a goatpox virus of aks strain isolated from from xinjiang southern as the research object , cloning and expressing KLP1 protein,Preliminary determining its molecular form by using molecular sieve; extracting Total RNA of diseased sheep tissue and constructing cDNA library, screenning protein interactions of KLP1 by using yeast two hybrid method,and vaoidating its accuracy by using ELISA, CO - IP, a PULL - DOWM and mammalian two hybrid method .Studying the effect of target protein on replication of goatpox virus by using RNA interference method ,determing the positions and intensity of interacting protein using fluorescence co-localization technology, constructing stepnise deletion plasmied of KLP1 screenning virus strains with different deletion ,using homelogous recombination methed,exploring the main pathogenic fragments of KLP1 gene,Analysing and darifying its biological function using biologiical softwaer and speculating mokecular pathogenic mechanism which can providing theoretical basis for further nuderstanding the kelch protein,the studying of goatpox virus and preventing and trsating goatpox.

羊痘病毒（CaPV）是毒力最强的动物痘病毒，其基因组呈线形，分中间的核心区和两侧可变区。KLP1位可变区，已证明其有明显的致病作用。但其生物学功能和致病的分子机理还不清楚。本研究拟以新疆南疆分离的山羊痘病毒aks株为研究对象，克隆表达KLP1蛋白，经分子筛，初步确定其分子的存在形式；提取病羊组织总RNA,构建其cDNA文库，用酵母双杂交的方法筛选KLP1的互作蛋白，并用ELISA、CO-IP、PULL-DOWM和哺乳动物双杂交的方法检测确证互作蛋白的真实性；采用RNA干扰的方法研究靶蛋白对羊痘病毒复制的影响，利用荧光共定位技术确定互作蛋白的作用部位及强度；构建KLP1基因分段缺失质粒，用细胞同源重组的方法筛选不同缺失的病毒株，研究KLP1主要致病的基因片段，并用生物软件分析，明确其生物学功能，推测其分子致病机理，为进一步了解Kelch蛋白、深入研究羊痘病毒、防治羊痘发生提供理论依据。

羊痘病毒（CaPV）是毒力最强的动物痘病毒，其毒力因子KLP1已证明有明显的致病作用。为了进一步研究其生物学功能和致病机理，本研究以新疆南疆分离的山羊痘病毒aks株为研究对象，分段克隆并原核表达KLP1的两个结构域，经镍亲和层析或切胶纯化方法得到了纯化蛋白，加弗氏佐剂免疫家兔制备多克隆抗体，并用ELISA 和Western blot检测；提取病羊皮肤组织总RNA,构建其cDNA酵母文库，构建KLP1的诱饵质粒，用酵母双杂交的方法筛选KLP1的互作蛋白，并用酵母双杂交回转鉴定和GST-PULL-DOWM方法检测确证互作蛋白的真实性；利用荧光共定位技术确定互作蛋白的作用部位及强度；对KLP1基因分段表达的不同结构域蛋白与筛选的互作蛋白做GST-pull-down实验，确证其与KLP1的相互作用位点；制备胎羊皮肤原代细胞，分离培养山羊痘病毒aks株，采用RNA干扰的方法研究靶蛋白对羊痘病毒复制的影响。同时对与KLP1相关的KLP2蛋白，037号核心蛋白和P32蛋白也做了初步研究。结果表明KLP1全长蛋白表达量很低，其N端结构域以可溶性蛋白表达于上清中，而C端蛋白则以包涵体形式表达在沉淀中，制备的多克隆抗体效价分别为1：512和1：256；制备的山羊皮肤cDNA酵母文库容量为107，以酵母双杂交筛选得到KLP1的互作蛋25个，经测序兼并变为9个，经回转验证只有5个互作蛋白，经pull-downt鉴定并成功能构建载体的只有Notch1蛋白；用荧光共定位技术表明KLP1与Notch1在细胞膜处明显共定位，且两蛋白在整个细胞中均有分布，但胞膜上分布较多，GST-pull-down结果表明Nocth1与KLP1的作用位点位于N端；降低Notch1的表达可使KLP1表达增加，说明Notch1具有抑制病毒复制的作用。这一结果可能为羊痘的防治提供新的思路,也为进一步了解羊痘的致病机理。