糖皮质激素受体（GR） 和microRNA1343对猪ATGL基因的表达调控研究

The Adipose triglyceride lipase (ATGL, also known as PNPLA2) is a key triacylglycerol (TG) lipase which specifically removes the first fatty acid from the triglyceride molecule generating diglyceride (DG) substrate for hormone sensitive lipase (HSL) in mammalian cells. Any slight variations on expression or activity of ATGL will affect the pig economic performances such as backfat thickness and lean meat percentage. In previous study, we found causative SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms ) at 5'UTR (5' untranslated region) of porcine ATGL gene which predicted to exist allelic differences in binding for transcriptional factor GR (Glucocorticoid Receptor), and microRNA miR-1343 was suggested by the data base to preferentially bound to 3'UTR of porcine ATGL gene. Therefore，GR and miR-1343 were considered to be candidate regulatory factors on transcriptional and post-transcriptional regulation of expression of porcine ATGL gene. At the transcriptional level, experimental methods of dual luciferase reporter gene assay system, electrophoretic mobility shift assay (EMSA), chromatin immunoprecipitation (ChIP), real-time RT-PCR, over expression assay, genetic association study will used to analyze the relationship between the genetic variants and the regulatory sequences for GR binding, along with the relationship between GR and expression of porcine ATGL gene. At the post-transcriptional level, from the point of view of miRNA-mediated regulation of porcine ATGL gene，a dual luciferase vector expressing the miR-1343 binding sites of ATGL 3'UTR will be constructed and the effect of miR-1343 on its activity will be evaluated by Dual-Luciferase Reporter Assay System. The research will describe novel insights into mechanisms of transcriptional and post-transcriptional regulation of porcine ATGL gene，explore the effects of GR and miR-1343 on expression of porcine ATGL gene, uncover the regulatory mechanism of the genetic effects of the nucleotide variations, and help to further understand the regulatory network of fat mobilization.

脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）是动物细胞内脂肪动用的关键酶，能特异水解甘油三酯第一酯键为激素敏感脂肪酶提供甘油二酯底物，其表达或活性上的轻微变异均有可能影响猪的背膘厚和瘦肉率。本项目依据在猪ATGL 基因5'UTR发现的糖皮质激素受体（GR）结合位点突变，以及3'UTR潜在的ssc-miR-1343结合位点，提出将GR和miR-1343作为候选的转录和转录后调控因子。转录调控上，拟利用双荧光素酶报告基因检测、凝胶阻滞电泳、染色质免疫沉淀、定量 RT-PCR、过表达分析、关联分析等验证突变与GR结合位点以及猪ATGL表达调控的关系。转录后调控上，利用双荧光素酶报告基因系统检测miR-1343与ATGL3'UTR的靶标关系。本研究将为猪ATGL基因的转录和转录后调控提供新的思路和依据，发现GR和miR-1343对猪ATGL的表达调控机理和点突变的遗传效应分子机制，丰富对脂肪分解调控网络的理解。

脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL，也叫PNPLA2）是动物细胞内脂肪动用的关键酶，能特异水解甘油三酯第一酯键，其表达或活性上的轻微变异均有可能影响猪的背膘厚和瘦肉率。本研究目的为从转录水平上对猪ATGL基因5’UTR区发现的突变进行检测和遗传效应评价，以及从转录后水平上筛选靶向结合3’UTR 区来调控ATGL基因表达的猪miRNA。.针对猪ATGL基因5’UTR区，我们发现了4个SNP位点，构建了3个单倍型，包括H1(GCCA)， H2(ATGC) 和 H3(GTGA)，分别在杜洛克、长白和中国地方猪中占优势频率。其中G-C-C-A的等位基因排列，即H1单倍型，在杜洛克猪中具较低的饲料转换率（FCR）和背膘厚度，但体外实验发现H1在HEK293细胞系中表现出较低的基本转录活性，而H2表现的启动活性最高。这可能由于点突变造成GR、ERα、AP2、Sp1、CAC结合蛋白等不同转录因子的结合，进而引起转录活性的差异。这些功能性多态位点的发现为进一步说明ATGL作为影响猪脂肪沉积和胴体性状的重要候选基因提供新的依据。.针对猪ATGL基因3’UTR区，我们采用生物信息学方法预测了10条靶向猪ATGL基因的猪miRNA，然后通过装载含猪ATGL基因3＇UTR序列构建pMIR-Luc报告基因载体，以及通过构建三个突变载体作为阴性对照，以pRL-TK载体作为内参，与候选miRNA模拟物共转染HEK 293T细胞，最终双荧光素酶报告基因试验显示ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下调293T细胞中pMIR-ATGL-3＇UTR的荧光素酶活性，而点突变试验证实了ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p能通过与猪ATGL基因3’UTR上预测的种子区结合下调荧光素酶活性。结果表明ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p通过靶向结合3＇UTR对猪ATGL基因有下调作用。.本研究将为猪ATGL基因的转录和转录后调控提供新的思路和依据，发现miR-1343对猪ATGL的表达调控机理和点突变的遗传效应分子机制，丰富对脂肪分解调控网络的理解。