基于生物探针膜的贝壳基质矿化功能蛋白质识别

贝壳等生物矿化材料具有轻质、高强、生物相容性好等诸多优点，相关性能显著优于人工制备的各种材料。在贝壳的碳酸钙矿化产物形成过程中，蛋白质等生物大分子与钙离子的相互作用发挥了至关重要的作用。然而，当前对生物矿化功能蛋白质的识别研究中，过多关注于矿化产物，忽视了矿化产物的形成过程，因而难以系统地获取与钙离子有着较强相互作用、并诱导其矿化的主要贝壳基质矿化功能蛋白质。针对这一现状，本项目拟基于高生物相容性的金纳米粒子/再生纤维素杂化膜体系，制备一种贝壳基质蛋白质生物探针膜，通过生物探针膜与钙离子相互作用的电化学信号识别出矿化功能蛋白质，并通过生物探针膜与自由矿化功能蛋白质诱导下的碳酸钙结晶实验对其矿化功能进行验证和研究，从而建立一种新型的生物矿化功能蛋白质识别方法。该方法可用于系统化、高通量地识别生物矿化功能蛋白质，将有效推进生物矿化机理与材料的相关研究进展。

贝壳珍珠层是在珍珠层蛋白质的指导下通过生物矿化作用形成的。研究珍珠层蛋白质对掌握珍珠和贝壳的形成过程，乃至了解全部生物矿化机理都有着重要意义。本项目从珍珠层蛋白质的提取分离、蛋白质种类和新蛋白质的鉴定、特定蛋白质的异源表达，以及负载于纳米金杂化再生纤维素膜的珍珠层蛋白质与钙离子的相互作用等方面进行了研究。使用酸溶法提取马氏珍珠贝贝壳珍珠层蛋白质。通过蛋白质电泳、质谱对其进行检测，研究结果表明，提取的珍珠层蛋白质主要成分与已经发现的马氏珍珠贝蛋白质一致，主要为Nacrein及其同源蛋白质；其余为与其他有壳类软体生物同源的蛋白质，并通过质谱鉴定发现了三种新蛋白质。开展了Nacrein和N16蛋白质在大肠杆菌体系内的表达和纯化工作。Nacrein在低温表达后产生包涵体、表达量低，经变性后使用亲和层析纯化，并通过Western Blot进行了鉴定。N16表达产生部分可溶性蛋白质，通过亲和层析即可将其纯化，可用于进一步表征与分析。制备了多种参数的纳米金杂化再生纤维素膜，研究了杂化膜的电极化处理以及杂化膜面积对其电化学性质的影响，通过循环伏安和交流阻抗方法对杂化膜作为电化学电极的可行性进行了验证。以杂化膜为电化学电极材料，开展了相关蛋白质与钙离子的相互作用研究。首先，在杂化膜上分别负载BSA和CaM，通过交流阻抗方法对BSA在杂化膜上的负载情况和CaM与钙离子的相互作用情况进行了研究。然后，将酸溶性珍珠层蛋白质和N16分别负载于杂化膜上，发现在与钙离子相互作用后，负载珍珠层蛋白质的杂化膜的高频阻抗显著增大，表明珍珠层蛋白质与钙离子确实存在较强相互作用，并且可以通过交流阻抗方法进行检测。上述研究成果为通过生物探针膜与钙离子相互作用的电化学信号识别矿化功能蛋白质的提供了技术基础，对简化矿化功能蛋白质的识别方法具有重要意义。