基于Vim/Clec7a/TLR4信号通路的元胡止痛方治疗CCI诱导的神经病理性疼痛作用机制研究

The pathogenesis and treatment of neuropathic pain is one of the most challenging problems in medicine and biology.Immune/inflammatory mechanism is the key to neuropathic pain.Yuanhu Zhitong prescription(YZP) corresponds well with unique understanding of traditional Chinese medicine “Qi and blood block cause pain”.Previous research confirm YZP has significant efficacy in the treatment of CCI induced neuropathic pain(NP) and discover essential molecular target "clec7a" associated with immune/inflammation which is closely related to neuropathic pain.Yuanhu Zhitong prescription can reduce the expression of clec7a in spinal cord, but the molecular regulatory mechanism of upstream and downstream for clec7a is not yet clear.On this basis, focusing on Vim/Clec7a/TLR4 signaling pathway,QRT - PCR, western blot and immunofluorescence are used to confirm that clec7a is the crucial molecular in YZP treating NP, and further by gene silencing or overexpression regulatory mechanism of upstream and downstream for Vim/Clec7a/TLR4/ TNF-α，IL-6，IL-1β signaling pathway is verified.This research subject provide new targets for the prevention and treatment of CCI-induced neuropathic pain, new ideas for traditional Chinese medicine treating NP and establish a theoretical basis for clinical application of Yuanhu Zhitong prescription,which has important theoretical significance and application value.

神经病理性疼痛的发病机制和治疗是医学和生物学中最富挑战的问题之一，免疫/炎症是神经病理性疼痛的关键机制。元胡止痛方（YZP）符合中医药对慢性疼痛“通则不痛，痛则不通”的独特认识。我们前期研究证实元胡止痛方对于CCI诱导的神经病理性疼痛（NP）有显著疗效，并发现免疫炎症相关的重要分子"clec7a"与神经病理性疼痛密切相关。元胡止痛方可降低脊髓中Clec7a分子表达，但对clec7a上下游分子的调控机制尚不明确，在此基础上，围绕Vim/Clec7a/TLR4通路，采用QRT-PCR，western blot及免疫荧光技术确证clec7a为YZP治疗NP的重要分子，并且进一步利用SiRNA基因沉默或过表达技术验证Vim/Clec7a/TLR4/ TNF-α，IL-6，IL-1β通路的上下游调控关系。本项目阐释元胡止痛方治疗神经病理性疼痛的分子机制为治疗慢性疼痛中药的研究提供新思路和新靶点。

神经病理性疼痛（NP）存在发病率高，病因复杂，机制不清楚，药物治疗局限等问题，深入研究其机制及治疗方法意义重大。醋制延胡索和白芷构成了元胡止痛方的小复方，方中元胡理气活血止痛，白芷抗炎镇痛，临床疗效显著。本项目首先确证元胡止痛方可以缓解CCI诱导的神经病理性疼痛。术后第十天取材，基于基因芯片和网络药理学的对假手术组、模型组、元胡止痛方给药组用Gene 2.0 Affymetrix芯片进行高通量筛选，并对差异基因进行基因功能分析、pathway分析，得到假手术和 CCI 模型比较差异显著且功能与神经病理性疼痛相关的13个候选基因，其中7个在模型中表达显著上调YZP 给药后表达显著下调的分子（Gal，Vip，Cckbr，Clec7a，Ccr2，Cryba2，Mmp12）。对这些候选基因进行初步的qPCR验证、文献调研及上下游通路分析，发现clec7a分子还未在神经病理性疼痛中有深入研究，并且很可能通过TLR4促进炎症因子的释放来调控神经病理性疼痛的。Western blot和免疫荧光结果表明clec7a无论蛋白水平还是形态学水平，CCI模型中表达明显上调，YZP给药后表达明显下降。新靶标通路的确证分别在疼痛早期（术后1,2,3天）疼痛持续期（术后7,8,9天）注射，发现机械痛敏及热痛敏都有明显改善，提示clec7a很可能对于疼痛早期及疼痛持续期都能发挥作用。TLR4及促炎因子在CCI诱导的神经病理性疼痛模型中表达明显升高，而鞘内注射clec7a抑制剂之后，表达量降低，说明clec7a介导TLR4及下游炎症因子的表达。元胡止痛方很可能通过调节clec7a/TLR4免疫炎症通路来治疗CCI诱导的神经病理性疼痛的。鞘内注射vim抑制剂，脊髓中clec7a表达也会下降，提示vim可能是clec7a的上游靶标。本项目为慢性疼痛中药的研究提供新思路和新靶点。