高效结合的i-motif DNA与荧光配体的结构设计及DNA纳米分析应用

Since the interactions of i-motifs with ligands are far weaker than those of G-quadruplexes, i-motif DNAs have not widely been used together with their ligands as signal reporters for DNA nanoanalysis, unlike G-quadruplexes. To resolve this problem, we introduce a GA-containing nucleotide segment into the 5’-terminal of a bimolecular i-motif and extend one parallel duplex of the i-motif core to provide an efficient binding site for a fluorescent ligand thioflavin T (ThT). Based on theoretical calculation, we tailor the molecular structrue of ThT and then synthesize and separate the target ligand, to improve its selectivity for i-motif structrues and make it applicable to DNA nanoanalysis. The above designed i-motif bimolecular structure and ThT derivate are characterized by circular dichroism, nuclear magnetic resonance, and mass spectrum. Then, we utilize the i-motif to guide the assembly of DNA nanoscaffolds, combined with ThT to report the fluorescent signal. The DNA nanoassembly process is monitored by gel electrophoresis, atomic force microscopy, and fluorescence spectroscopy. With this basis, we further apply the i-motif–directed and –reported DNA nanoassembly system to label-free aptasensor-based analysis under acidic physiological conditions, and provide a new strategy to fluorescent microscopic pH imaging of the acidic microenvironments on cancer cell surfaces.

由于i-motif与配体作用效率远不及G-四链体，i-motif DNA不像G-四链体那样与其配体一起被广泛用作DNA纳米分析的信号读出器。针对此问题，我们在双分子i-motif的5’端引入含GA碱基片段，将i-motif核心结构中一条平行双链延长，为荧光配体硫磺素(ThT)提供高效结合位点。基于理论计算，对ThT分子结构进行裁剪，再合成分离，以改善对i-motif的选择性，适合DNA纳米分析。以上设计的i-motif双分子结构和ThT衍生物以圆二色谱、核磁共振、质谱进行表征。然后，以该i-motif来引导DNA纳米脚手架组装，结合ThT读出荧光信号，利用凝胶电泳、原子力显微镜、荧光光谱法对DNA纳米组装过程进行监控。在此基础上，我们将i-motif引导并指示的DNA纳米组装体系应用于酸性生理条件下的无标记适配体传感分析中，为癌细胞表面酸性微环境的pH荧光显微成像提供新思路。

G-四链体（G4）和i-motif是两种常见的DNA四链螺旋结构，具有一些相似性质，例如它们结构稳定且易于调控，故在DNA纳米组装方面均有广泛用途；但不同的是，i-motif与配体作用效率远不及G4，使其不能像 G4那样与荧光配体一起被广泛用作DNA纳米分析的无标记信号读出器。鉴于此，本项目主要围绕双分子i-motif结构与配体设计开发及无标记DNA纳米分析应用开展工作。首先，我们在i-motif核心结构一侧引入小段含GA的平行双链，为苯并噻唑类荧光配体如硫黄素（ThT）等提供一种普适性高效结合位点，很好地解决了传统i-motif与配体作用效果差的问题，另外借助平行双链手柄，实现了异源双分子i-motif结构的可控折叠，引导DNA纳米脚手架进行有序组装。进一步地，我们根据上述设计的i-motif结构及其荧光配体，发展了一种全新的无标记DNA纳米分析与高对比度细胞成像方法，用于癌细胞表面pH荧光成像以及DNA逻辑回路动态监测方面。此外，我们结合理论计算，对ThT分子结构中二甲氨基、噻唑N上甲基、芳香环间C-C键进行替代和优化，设计合成了一系列含吡咯烷基的苯并噻唑类荧光配体，并通过噻唑N上的功能团，使荧光配体的工作pH正好符合癌细胞表面酸性微环境，在细胞微环境中目标物逻辑传感分析方面取得良好效果。另外，我们还设计了其他pH响应的四链体结构，并用于细胞荧光成像分析。总之，本项目有力展示了设计开发DNA功能结构及相关配体的新思路，有利于拓展四链DNA在纳米组装与生物分析领域的应用前景。