基于miRNA-mRNA调控网络药理驱动子的识别分层揭示丹红注射液治疗慢性稳定型心绞痛的药理机制

Abstract.Network analysis can provide methodological feasibility for multi-component-targets intervention of Chinese herbal preparation and novel direction for reveling molecular relationship between complex diseases and medicine. In pharmacology, network analysis will focus on hierarchical understanding of targeted network and identification of key target consequentially. This study is based on phase IV clinical study of Dan Hong Injection on treating stable angina pectoris. On the premise of exact drug efficacy, we use miRNA and mRNA dual-sequencing data to construct miRNA-mRNA regulatory networks and identify network modules. Composite centers screening strategy was used to identify pharmacological drivers (a kind of entity node which has ability of driving conformation of pharmacological network structure and module) of this regulatory networks. Then, for pharmacological drivers, topological structure verification and myocardial ischemic cell model-based biological validation will be co-executed. Our study aims at identifying pharmacological drivers and shows layered pharmacological mechanism by deconstructing miRNA-mRNA-module network, finally, revealing multi-ways interventional mechanism on treating stable angina pectoris by Dan Hong Injection and providing clinical evidence.

网络分析对于中药多组分、多靶点的复杂干预提供了方法学的可行性，为解构复杂疾病、药物之间分子相互作用关系提供了新颖的药理机制研究方向，但网络分析在药理学上的应用必然走向靶点网络的层次化解析及关键靶点的识别。本项目基于具有良好临床基础的丹红注射液治疗稳定型心绞痛的IV期临床研究，在确定疗效的基础上，将新一代miRNA和mRNA双测序数据构建miRNA-mRNA调控网络并识别网络模块，采用复合中心筛选策略对该网络进行药理驱动子（即对药理网络结构、模块构象具有重要驱动作用的实体节点）的识别，并对药理驱动子进行拓扑结构验证，同时采用心肌缺血细胞模型进行生物学实验验证。本研究以药理驱动子为目标，在分解miRNA-mRNA-模块复杂网络的基础上进行分层药理机制分析，以揭示丹红注射液对稳定型心绞痛的多途径干预机制，为临床用药提供科学依据。

大量临床证据显示中药复方丹红注射液治疗稳定型心绞痛疗效确切。对于复杂疾病的中药复方干预，我们致力于借助系统分析框架、分层解构药理驱动单元以聚焦多核心机制，并溯源参与相关转录调控的上层靶标分子。本研究基于对丹红注射液治疗稳定型心绞痛IV期临床研究的人血样本进行miRNA和mRNA双测序，对6个差异表达miRNA进行靶标预测，所得预测mRNA（137个）连同差异表达mRNA（102个）通过网络模拟构建miRNA-mRNA、miRNA-mRNA及其一阶邻居分层调控网络，采用复合中心筛选策略对该两个网络进行层次化降维解析，共识别出2个药理核心模块和6个药理驱动子（BAZ2A、CDC5L、EFTUD2、SF3A2、SNRPF、SF3A1），网络拓扑结构验证证实了其结构核心地位。同时，我们展示了2个药理核心模块上、下游的多级驱动关系（hsa-miR-320e → BAZ2A → core module2、hsa-miR-197-5p → SF3A1 → core module3），前者功能主要涉及脂代谢、心肌细胞功能、血管内皮功能的调控，后者集中于免疫炎症与自噬、心脏发育、乏氧与线粒体功能、心肺功能与血压的调节。同时，网络的功能富集分析显示，药物机制可能涉及调节血管内皮功能、免疫调节、抑制氧化应激反应和炎症、修复受损心肌细胞结构及改善心脏泵血功能、减轻由有害物质引起的心肌损伤、保护心肌细胞免于凋亡等。细胞实验证实，丹红注射液25mg-0.78生药/ml为最大无毒浓度，3.125mg生药/ml为最佳给药浓度；CCK-8检测显示丹红注射液呈浓度依赖性的使缺血AC16细胞的存活率上升，对缺血AC16细胞有保护作用。此外，RT-PCR及Western Blot分别对驱动子进行基因（BAZ2A、CDC5L、EFTUD2、SF3A2、SNRPF、）和蛋白（CDC5L、EFTUD2）表达量验证，结果显示较模型组均具有显著性差异(P＜0.05)。