泛素连接酶RNF138对结直肠癌细胞生物学行为的影响及分子机制研究

More and more studies have shown that the ubiquitin ligase is closely related to the occurrence and development of tumor. Our previous studies demonstrated that ubiquitin ligase RNF138 was highly expressed in colorectal cancer cell line HCT-116. HCT-116 cell line was chosed as the targeting cell to construct RNF138 knockout cell. By using cell proliferation experiments, including CCK-8, clone formation and soft agar, we found that RNF138 could promote the proliferation of tumor cells, and the protein level of protein kinase NLK, which is intimately associated with apoptosis, declined with the knockout of RNF138. NLK could be ubiquitinated by RNF138. Those date suggest that RNF138 may be involved in the development of colorectal cancer by regulating apoptosis. The aim of the present project is to define the expression pattern of RNF138 in colorectal cancer tissues,and the effects of RNF138 on the biological behaviors including proliferation, migration and invasion of colorectal cancer cells and its tumorigenesis ability will be investigated. The possible molecular mechanisms of whether RNF138 functions in the tumorigenesis and development of colorectal cancer by regulating apoptosis will be revealed preliminarily.This project will provide important clues to find new molecular drug targets for the diagnosis and treatment of colorectal cancer and new ideas for further study the functions of RNF138.

越来越多的研究表明泛素连接酶与肿瘤的发生发展关系密切。我们先前研究发现泛素连接酶RNF138在结直肠癌细胞系HCT-116中高表达，而以HCT-116为靶细胞，通过体细胞基因敲除技术剔除RNF138后，靶细胞表现出明显的增殖和克隆形成能力降低，提示RNF138影响结直肠癌细胞的增殖，同时发现与细胞凋亡密切相关的蛋白激酶NLK的蛋白水平随着RNF138的缺失而降低，且可被RNF138泛素化，提示RNF138可能通过调节细胞凋亡而参与结直肠癌的发生发展。本研究旨在通过临床资料、整体动物和细胞水平的层面，综合分析RNF138在结直肠癌组织中的表达规律，与结直肠癌发生发展的关系和临床意义，对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和成瘤等生物学行为的影响，同时初步阐明RNF138是否通过调节细胞凋亡参与结直肠癌发生发展的分子机制，为寻找诊治结直肠癌的新分子药物靶标和进一步研究RNF138的功能提供重要线索。

我们先前研究发现泛素连接酶RNF138在结直肠癌细胞系HCT-116中高表达，在HCT-116中剔除RNF138后，靶细胞表现出明显增殖和克隆形成能力降低，提示RNF138影响结直肠癌细胞增殖，同时发现与细胞凋亡密切相关的蛋白激酶NLK水平随RNF138缺失而降低，且可被RNF138泛素化，提示RNF138可能通过细胞凋亡参与结直肠癌发生发展。本研究旨在多层面分析RNF138在结直肠癌组织中表达规律，对结直肠癌细胞增殖等生物学行为影响，初步阐明RNF138参与结直肠癌发生发展分子机制。取结肠癌患者癌组织及相应癌旁组织78对，通过组织芯片和Real-time PCR检测到RNF138在癌组织中表达明显高于相应癌旁组织。成功构建RNF138过表达及RNAi慢病毒载体，感染结肠癌细胞系获得稳定转染细胞株，进行细胞增殖相关实验结果显示稳定过表达RNF138细胞株增长速度及集落形成显著快于对照组，而稳定敲低RNF138细胞株增长速度及集落形成明显慢于对照组。根据已有工作基础，RNF138可能与NLK协同作用，故在结肠癌细胞株中成功进行NLK基因敲除，细胞增殖实验结果显示NLK基因敲除后，细胞生长和集落形成明显受抑，与RNF138基因敲除后肿瘤细胞表型一致。我们有研究提示NLK促进GC-1细胞凋亡，NLK表达随RNF138敲除而降低且RNF138能够在体内泛素化NLK，所以此结果提示RNF138可能通过参与细胞凋亡与NLK协同作用参与结肠癌发生发展。为了深入探索RNF138发挥功能分子机制，通过蛋白芯片和酵母双杂交筛选到24个与RNF138相互作用的基因，除UBE2K己有报道与RNF138相互作用，其余蛋白有待进一步细胞验证。Luciferase实验结果提示RNF138可能参与SRE、NFAT信号通路，同时应用Agilent人全基因组表达谱芯片检测野生型和RNF138-/-型HCT-116细胞株全基因表达情况拟通过比较差异表达基因确定RNF138参与调节的主要信号通路。以上结果表明，RNF138在癌组织中表达明显高于相应癌旁组织，RNF138表达水平显著影响结直肠癌细胞生物学行为，其高表达使结直肠癌细胞恶性程度增加，提示RNF138可作为结直肠癌恶性程度预测指标，同时该研究表明RNF138可能通过调节SRE、NFAT信号通路及细胞凋亡与蛋白激酶NLK协同作用参与结肠癌发生发展。