基于细胞表面特异识别的多色量子点标记小分子抗体提高食管癌外周血循环肿瘤细胞的检测

Circulating tumor cell (CTC) has an important value in the diagnosis and evaluation prognosis of malignant tumors and it has been used to assess the prognosis of metastatic breast cancer, prostate cancer and colorectal cancer. Esophageal cancer is one of common malignant tumors in our country, while the CTC of Esophageal squamous cell carcinoma is still in research stage and the lack of high specificity and sensitivity of the detection methods are still a bottleneck into clinical detection. This project on the basis of previous work is to screen single-chain antibodies from a large phage antibody library, using mixed esophageal cancer cells as targets. The proteins associated single-chain antibodies are expressed in prokaryotic system and optimized expression conditions. After purification proteins by affinity chromatography, the biological functions are analyzed. The tumor cells antigens binding to single-chain antibodies will be identified by protein-protein interaction and mass spectrum methods. Eventually an efficient method will be set up combining scFv with quantum dot to specifically recognize CTC in peripheral blood with high sensitivity and specificity. It will be used to enrich CTCs from the peripheral blood of esophageal cancer patients, guiding disease classification and monitoring tumor recurrence and metastasis, to realize individualized diagnosis and treatment.

循环肿瘤细胞（CTC）在恶性肿瘤的诊断及评价预后等方面具有重要的价值，目前已用于转移性乳癌、前列腺癌及结直肠癌的预后评估。食管癌是我国常见恶性肿瘤之一，而食管癌患者外周血CTC的研究尚处在研究阶段，缺乏高特异性和敏感性的检测方法仍是CTCs应用于临床检测的瓶颈。课题组前期以混合的食管癌细胞为靶，从大容量噬菌体抗体库中获得多株与食管癌细胞相关抗原结合的特异性单链抗体。本项目拟通过原核系统表达和纯化抗体后，将这些单链抗体与特定光谱的量子点偶联，建立一种基于表面特异识别的食管癌外周血CTC的高灵敏度和特异性的检测方法，以期应用量子点标记食管癌细胞单链抗体辅助其他的检测方法，提高食管癌外周血中CTC的检出率，从而有效指导食管癌危险分级、早期诊断、辅助治疗、监测肿瘤复发和转移，实现个体化诊疗。

循环肿瘤细胞（CTC）已用于转移性乳癌、前列腺癌及结直肠癌的预后评估，食管癌是我国常见恶性肿瘤之一，而食管癌患者外周血CTC的研究尚处在研究阶段，缺乏高特异性和敏感性的检测方法仍是CTC s应用于临床检测的瓶颈。课题组以混合的食管癌细胞为靶，从大容量噬菌体抗体库获得多株与食管癌细胞相关抗原结合的特异性单链抗体。本项目通过原核系统表达和纯化抗体后，将单链抗体与特定荧光偶联，建立基于表面特异识别的食管癌外周血CTC的高灵敏度和特异性的检测方法，用多色荧光标记单链抗体辅助其他的检测方法提高食管癌外周血CTC的检出率，为食管癌的早期诊断和治疗提供新的有效策略和手段。.1).采用SDS-PAGE及Western印迹、细胞ELISA分析噬菌体抗体与肿瘤细胞结合特异性及结合活性；2).通过不同的肿瘤细胞进行鉴定，结合免疫荧光（IF）、等技术鉴定肿瘤细胞，验证偶联荧光抗体检测肿瘤细胞的灵敏度和特异性；3).将单链抗体重新构建表达载体，进行可溶性及包涵体形式表达，分离纯化后，经过蛋白-蛋白相互作用及质谱鉴定，初步探讨其结合的抗原；4). 多色荧光标记抗体用于食管癌患者外周血CTC检测，比较分析临床病例食管癌CTC的检出数目，探讨此方法临床应用的可行性。.成功构建了重组载体pet-NFC20b、pet-NFC70a，对重组菌株pet-NFC20b、pet-NFC70a蛋白表达进行鉴定，诱导条件均为0.5mM IPTG、时间3h、温度18℃，重组蛋白均以包涵体形式表达，经滴定复性后均获得可溶性重组蛋白。目的蛋白的相对分子质量约为30-45kD。.将单链抗体与荧光偶联，分析抗体对于食管癌细胞及其食管癌患者外周血CTC的鉴定效率。.将表达的抗体标记荧光ifro-488，用斑马鱼模型进行荧光抗体检测肿瘤细胞工作：分别将荧光标记的人食道癌细胞KYSE170，KYSE180移植到斑马鱼体内，建立斑马鱼肿瘤移植模型；用抗体进行示踪鉴定与肿瘤细胞的亲和活性。用荧光标记抗体用于食管癌患者外周血CTC检测，分析食管癌患者CTC的检出数目，评估此项技术的应用价值。