罂粟碱促进视网膜神经节细胞轴突再生的机制研究

In the screening drugs for optic nerve injury, we found that papaverine (PAP) could suppress LPS induced microglial and muller glial activation by inhibiting NF-κB signal pathway in a dose dependent manner. More importantly, we also demonstrated PAP could boost the axonal regeneration in a rat RGC primary culture system and inhibit the apoptosis of RGCs in a rat optic nerve transection model. Therefore, PAP might be a promising candidate for inhibiting RGC apoptosis and promoting axonal regeneration in optic nerve injury therapy, however, the in-depth molecular mechanism is still needed to be investigated.. PAP is a pan-phosphodiesterase inhibitor which is clinically used to treat visceral spasm and vasospasm. We hypothesize that (1) in vitro, PAP promotes the intrinsic axonal regeneration of primary RGCs by activating cAMP/PKA/CREB signal pathway and its downstream signals such as PI3K/Akt/mTOR and MEK/ERK. (2) in vivo, PAP also could inhibit the RGCs apoptosis, suppress the over activated glial responses, and increase the intrinsic ability of axonal regeneration after optic nerve injury by cAMP/PKA/CREB and its downstream effectors. In this study, we will investigate the targets and molecular mechanisms of PAP on cell survival and axonal regeneration of RGCs which would provide scientific evidences in PAP therapy for optic nerve injury.

在视神经损伤治疗药物筛选过程中，发现罂粟碱(PAP)能够抑制小胶质细胞和穆勒细胞活化及炎症介质释放，改善视网膜免疫微环境。进一步预实验还显示，PAP能促进原代视网膜神经节细胞（RGC）的轴突再生，抑制大鼠视神经横断伤后RGC的凋亡。提示PAP有可能成为视神经损伤中抑制RGC凋亡和促进轴突再生的有效药物，需要进行深入研究。. PAP是一种扩血管药物，属于磷酸二脂酶抑制剂。推测：1) 在体外，PAP促进原代RGC轴突再生是通过活化cAMP/PKA及其下游通路(PI3K/Akt，MEK/ERK)来实现；2) 在体内，PAP也能通过活化cAMP/PKA及下游通路，抑制损伤后RGC凋亡和胶质细胞过度活化，激发RGC轴突再生，促进视神经损伤的修复。本课题将对PAP的作用靶点及信号转导通路进行研究，阐明PAP抑制RGC凋亡和促进RGC轴突再生的分子机制，为PAP治疗视神经损伤提供科学依据。

视网膜神经节细胞（RGCs）是视网膜唯一的输出神经元，在信号处理之前承担着将视觉信号传输到大脑皮层更高视觉中心的关键作用。在眼科常见的疾病如：青光眼、外伤性视神经病变中均伴有不同程度的视网膜神经节细胞轴突的损伤、轴突再生障碍。因此促进视网膜神经节细胞轴突的再生是眼科基础研究领域的热点。.课题主要探讨：.第一、SD大鼠原代视网膜神经节细胞的分离、纯化和培养。.第二、 罂粟碱对体外、体内视网膜神经节细胞轴突再生的效果以及作用机制。.第三、罂粟碱对抑制小胶质细胞以及穆勒胶质细胞在炎症反应过程中的作用以及相关机制。 .我们发现：.（一）采用我们团队改进的两步免疫盘化法，可以分离、获取产量更高，纯度较高的SD大鼠原代视网膜神经节细胞。.（二）在外，2μg/ml罂粟碱能够明显促进SD大鼠原代视网膜神经节细胞轴突再生，并且能够促进轴突克胶质瘢痕物质(CSPGs)再生。罂粟碱是通过升高cAMP的表达水平，通过cAMP/PKA、PI3K/AKT、MEK1/2/ERK1/2通路影响RhoA、MLC2、Rac1、GSK3β、Neuropilin-1、BDNF等的表达水平促进轴突的再生。同样，在SD大鼠体内500μg/ml罂粟碱促进视神经损伤修复的效果最明显。并且在体内也进一步验证了罂粟碱的作用机制。.（三）罂粟碱能够通过MEK/ERK通路抑制LPS诱导的原代视网膜小胶质细胞活化，减少TNF-α, IL-1β的表达，促进IL-10的表达。并且，MEK/ERK通路可能部分受cAMP/PKA通路的调节。.（四）不同浓度罂粟碱对抑制LPS诱导活化的穆勒细胞的炎症反应效果不同，其中以0.4 μg/ml效果最明显，显著减少炎症因子TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE2的释放，促进抗炎因子TNF-β、 IL-10的释放，增加营养因子BDNF, CNTF, IGF-1的表达，并且能够减少穆勒细胞活化后所产生的胶质成分GFAP蛋白的表达。..本研究改进了原代视网膜神经节细胞的分离、纯化方法，首次在体外和体内同时证明罂粟碱能够促进视网膜神经节细胞轴突再生，并且初步探究了其机制；首次对罂粟碱抑制小胶质细胞、穆勒细胞活化的效应和机制进行了阐明,为临床视神经损伤的治疗，提供了实验依据。