多亚型视网膜神经节细胞轴突的再生和视觉功能的修复

Visual function recoveryIt is well known that automatic regeneration following mammalian brain or spinal cord injury is extremely difficult. In most cases, majority of the injured neurons die. The mouse retina and its axonal projection to the brain provide an ideal model for solving regeneration questions. The advantage of the retina is that it is also part of the central nervous system (CNS) with distinct lamination and multiple neuronal subtypes. In this project, we propose to use the new Targeted Locus Amplification (TLA) method to map the insertion site of the reporter genes of existing RGC lines; insert Crerecombinase gene to the exact locus to replace the reporter gene in individual retinal ganglion cell (RGC) subtypes using CRISPR/Cas9 technique; identify new intrinsic molecules with biological safety to promote regeneration of RGC subtypes based on techniques and methods from our previous work and design a “cocktail” approach to combine multiple intrinsic molecules to regenerate RGC subtypes; use two-photon populationfunctional imaging to test RGC visual responsiveness, electrophysiological recording and retrograde tracing to detect recovery of synaptic connectivity upon injury and after regeneration and behavioral assay to detect of recovery of visual behaviors including visualacuity after axon regeneration. Our study aims to deepen the understanding of axonal regeneration at the molecular level and develop clinical therapies for axon regeneration after human CNS injury.

众所周知，哺乳动物大脑或脊髓损伤后的自发性再生非常困难，多数情况下大部分受损的神经元均会死亡。小鼠视网膜及其对大脑的轴突投射提供了解决再生问题的理想模型。视网膜的优势在于它也是大脑中枢神经系统（CNS）的一部分，具有清晰的分层和多种细胞亚型。本研究拟以靶向位点扩增（TLA）新方法绘制现有RGC品系的报告基因的插入位点，然后利用CRISPR/Cas9技术建立标记视网膜神经节细胞（RGC）亚型的Cre重组酶小鼠品系；基于我们之前工作总结的技术和方法鉴定促进RGC亚型再生的具有生物安全性的新型内在因子和新型的联合内在因子“鸡尾酒”促再生方法；并利用双光子群体神经元功能成像检测RGC视觉响应，电生理记录和逆行示踪检测损伤和修复后的突触连接，行为学测试检测修复后视敏度等视觉行为功能的恢复状况。本研究旨在促进我们对轴突再生能力的分子水平的认识和对人类CNS损伤再生的临床治疗方案的开发。

视觉通路损伤后再生的研究对视觉功能的恢复至关重要，视网膜神经节细胞（RGCs）是将视觉信息传到大脑的唯一输出，是视觉系统的关卡所在。小鼠视网膜急性损伤模型中，αRGC亚型的存活率最高，且具有更强的再生能力。损伤后αRGC亚型选择性的高表达骨桥蛋白（OPN）和胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）可能是其具有更强再生能力的基础。我们希望找到更多促进αRGC亚型损伤后存活和再生的内在因子，并希望发现OPN/IGF-1促进αRGC再生的分子信号通路，从而找到促进损伤后神经元再生的新分子工具。我们通过对αRGC进行单细胞RNA测序分析，发现了两个新的亚型及其分子标记Kcnip2和Etv1，我们构建了Kcnip2-CreER和Etv1-CreER小鼠品系，并发现Kcnip2 αRGC为OFF瞬时发放αRGC，而Etv1 αRGC为OFF持续发放的αRGC亚型。Etv1可能是潜在的促进αRGC损伤后再生的分子。另外我们发现αRGC特异性高表达OPN受体整合素 α-V 亚基（ItgaV），这可能是αRGC对OPN / IGF-1 信号的选择性再生反应的分子机制。同时我们进一步验证了与急性损伤模型结果相似，在慢性损伤（高眼压）即人青光眼疾病模型中，αRGC和ipRGCs存活率更高，并且OPN在慢性损伤模型中的表达水平也明显增加，进一步验证了OPN对于疾病过程中RGCs再生能力的重要性。在人体视网膜中我们也发现OPN在α样RGCs中有表达，且OPN水平与青光眼疾病严重程度呈正相关。我们的研究发现了促进αRGC损伤后促进再生新的因子以及响应OPN/IGF-1进行再生的特异受体，并在人青光眼疾病中发现了OPN对αRGC神经元的潜在保护作用，这些结果为我们寻找治疗青光眼等疾病中神经元损伤的方法提供了基础。