基于能量与分子动态的超耐热葡萄糖氧化酶设计

Glucose oxidase (GOD) is one of the most important commercial enzymes in food industry. GOD has found various applications including food preservation, oxygen removal and wheat dough strengthening etc. However, the applications of GOD in gluconic acid production and animal feed industry are hampered by its low thermostability. Hence, the development of novel hyper-thermostable GOD is highly desired. In this project, we will develop and use a computational strategy which combines energy- and dynamic- based approaches to identify stabilizing mutations. By systematically combining these mutations, we anticipate that the thermostablity of GOD can be substantially increased. The computational strategy developed in this project will facilitate the development of robust enzymes for biotechnological applications.

葡萄糖氧化酶是食品工业中一种重要的工业酶，被应用于食品保质，脱氧，改性等领域。目前商品化生产的葡萄糖氧化酶热稳定性较差，限制了其在葡萄糖酸盐制备和饲料等领域的应用。因此，提高葡萄糖氧化酶的热稳定性，使其能适应严苛的工业生产要求，是需要迫切解决的问题。本课题将以黑曲酶来源的葡萄糖氧化酶为研究对象，通过结合静态解折叠自由能计算和动态分子动力学柔性考察的方法，对该酶进行计算机改造设计，以期获得耐热性大幅提高的新型超耐热稳定葡萄糖氧化酶。本课题中涉及的蛋白质计算机进化方法学研究也将为各种重要的工业酶的进化改造提供科学依据和实践基础。

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称GOD，EC1.1.3.4) 是食品工业中一种重要的工业酶，可利用分子氧作为电子受体催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸-δ-内酯及H2O2，葡萄糖酸-δ-内酯在内酯酶的作用下或自发生成葡萄糖酸(Gluconic acid，GA)。基于GOD催化反应这一特点，其在食品、饲用、饮料、纺织、制药、建筑等领域具有广泛应用，商业价值和前景巨大。然而GA的生产成本较高，GOD作为催化葡萄糖生产葡萄糖酸的工业用酶，其催化效率高度依赖于酶的稳定性。本研究中，我们通过计算机蛋白设计技术，对来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶(AnGOD)进行稳定性改造。设计得到的最佳突变组合(AnGOD-m)熔融温度相较于AnGOD提高了8.5 °C，在显著提高该酶热稳定性和热催化活性同时，AnGOD-m对于低温区活性并未受到影响。此外，AnGOD-m在pH 6.0和7.0条件下可保持较高活性，相比之下野生型在此条件下迅速失活。在葡萄糖酸产量方面，AnGOD-m生产葡萄糖酸的产量相较于野生型提升近2倍，在18 h内几乎能够完全转化D-葡萄糖，并可生成324 g/L的葡萄糖酸。总体而言，本研究通过计算机蛋白设计技术获得了新型超耐热稳定葡萄糖氧化酶，具有在严苛工业环境的应用潜力。其改造过程中涉及的蛋白质计算机进化方法学研究也将为各种重要的工业酶的进化改造提供科学依据和实践基础。