啤酒大麦转基因技术及籽粒蛋白质遗传表达调控研究

Beer barley production and malting industry are regional and special industry in Gansu province. Its planting area is located in Hexi corridor， with high fertility and irrigation. But high protein content of beer barley seeds is a major limitation to healthy development of the industry because the varieties planted here are too sensitive to N fertilizers. This study proposed to apply RNAi genetic regulation mechanism to decrease the protein content of beer barley seeds by transgenic methods.Study about RNAi regulation to plant growth and development is recently a hot field, and some successful events have been reported. however, it is not found that using RNAi to control the protein metabolism and accumulation in beer barley seed. The study will theoretically explore the molecular biological mechanism of storage protein in barley seed, showing the relationship between RNAi and accumulation of seed protein. Meanwhile, it may result in new theory and path for transgenic improvement of crop quality. And it also will create new germplasm which is not sensitive to N fertilization. This will establish substantial foundation for new varietie breeding of beer barley.

啤酒大麦是甘肃省区域特色优势产业，种植带位于河西走廊高水肥灌区。现种植品种对氮肥过于敏感、导致国产原料蛋白质含量超标是影响啤酒大麦产业健康发展的主要障碍。本项目拟应用RNAi对代谢的遗传调控理论，通过遗传工程操作引起相关基因"沉默"，从而达到改变籽粒蛋白质代谢途径，实现降低其醇溶蛋白质含量，进而降低种子籽粒粗蛋白质含量的目的。RNAi调控植物发育和代谢已成为国际上最为活跃的研究领域，在作物品种改良上已有成功应用的报道，然而将其应用于大麦籽粒贮藏蛋白的代谢和积累的创新研究，目前国内外还没有实验报道。在理论上，本项目将探讨大麦籽粒蛋白质积累的分子生物学机制，揭示RNAi与籽粒蛋白质积累的关系，可为利用转基因技术改良作物品质提供新的理论依据和思路；在实践上，本项目将创造出对氮肥不敏感的啤酒大麦种质资源，为选育低蛋白质含量、对氮肥不敏感的啤酒大麦新品种奠定物质基础。

大麦蛋白质含量是影响大麦籽粒酿造品质的主要指标。利用生物技术培育蛋白质含量适宜的啤用大麦是保障啤酒大麦产业健康发展的重要手段之一。本研究采用同源PCR方法克隆大麦B-hordein 核心保守序列，通过Gateway技术及限制性酶切、亚克隆构建RNAi 植物表达载体，利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise 和甘啤4号外植体；通过潮霉素涂抹筛选、PCR 检测、Southern 杂交验证目的基因RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合和遗传传递，采用荧光定量PCR 分析大麦花后不同发育时期B-hordein 转录表达情况；开展氮素处理及高氮素氮肥运筹相关试验，采用近红外谷物分析仪及蛋白提取后Brandfrod定量两材料总蛋白、醇溶蛋白，并利用SDS-PAGE分析醇溶蛋白组分含量。结果表明:（1）聚类分析和序列比对证实获得2条349bp的大麦B醇溶蛋白基因片段，获得大麦B-hordein RNAi 植物表达载体2份，即Ubi 启动子驱动的pBract207-zz-gp4和GaMV 35s 启动子驱动的pART27-GP4，通过转化幼胚获得转化植株13株，Golden Promise 和甘啤4号转化效率分别为6.3%和1.3%；（2）连续5代PCR分子检测均能扩增到RNAi构件2条目标片段，Southern 杂交检测证实RNAi 构件稳定整合到转基因大麦基因组，发育阶段B-hordein基因的qRT-PCR （SYBR Green Ⅰ）动态分析显示RNAi大麦表达量低于对照，获得稳定株系1份；（3）相比对照，转基因大麦B醇溶蛋白B1、B3亚基相对含量比对照降低22.87%，50.65%，醇溶蛋白含量显著降低，降幅为34%，籽粒粗蛋白质含量降低1-2%，高氮素条件下转基因大麦醇溶蛋白含量增加幅度显著低于对照。本研究结果不仅验证了RNAi对大麦籽粒蛋白质积累的调控作用，也为选育低醇溶蛋白、对氮肥不敏感的啤酒大麦新品种奠定基础，并为禾谷类作物品质改良提供有益借鉴。