冷水鱼杀鲑气单胞菌病的发生及免疫防治机理研究

The bacterium Aeromonas salmonicida is the pathogen of furunculosis, infecting mainly Atlantic salmon, turbot and other cold water fish. The bacterium is divided into 5 subspecies, and the most epidemic and harmful is the subspecies A. salmonicida masoucida in north China. Our unpublished analysis shows that the genome of this subspecies contains four sets of type III secretion systems (T3SSs) and one set of type VI secretion system (T6SS). We intend to identify the effector molecules encoded in these virulence islands, and to identify host proteins targeted by these effectors in order to elucidate the molecular pathogenesis of the secretion systems. On the basis of epidemiological surveys, it is also intended to clarify the major subspecies and their susceptible marine fish species. Furthermore, inactivated vaccine and suitable adjuvants will be developed and optimized for the prevention of the disease in China. The specific antibody titer in serum and B lymphocyte proliferation, together with the transcriptome and proteomics in skin and head kidney will be examined comparatively to monitor and to understand the immune protection mechanisms provoked in vaccination. It is hoped that this proposed study will contribute to the understanding of A. salmonicida pathogenicity and to the immune prevention of furunculosis in China and in the world.

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是冷水性鱼类的重要致病菌。我们在前期研究中发现该菌是近年来引起我国北方养殖的鲑鱒和鲆鲽的冬季病害的主要病原。本项目拟研究该病原菌的Ⅲ型和Ⅵ型分泌系统的效应分子及其宿主靶蛋白，揭示其分子致病机理；开展杀鲑气单胞菌流行病学研究，明确该病原的流行亚种及其易感鱼类；优化杀鲑气单胞菌灭活疫苗的制备条件和免疫方法，研制适合易感鱼类的高效疫苗；比较免疫前后的大西洋鲑/大菱鲆被杀鲑气单胞菌感染时，特异性免疫分子的应答及B淋巴细胞的增殖，并结合皮肤和头肾的转录组和蛋白质组表达差异，阐明宿主免疫应答和疫苗免疫保护的分子机理。上述研究结果将揭示杀鲑气单胞菌病的发生和疫苗免疫保护的分子机制，为冷水鱼疾病的免疫防控提供理论基础。

杀鲑气单胞菌是水产养殖中的重要病原菌，威胁我国北方的鲑鳟类、鲆鲽类等重要水产养殖品种。本项目开展了杀鲑气单胞菌的流行病学调查，建立了杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的PCR检测方法，筛选了适合鲆鲽类使用的油乳化佐剂Marcol 52，建立了杀鲑气单胞菌的发酵、灭活和乳化工艺，研发了大菱鲆杀鲑气单胞菌灭活疫苗，其免疫保护率超过80%，免疫持续期超过24周。围绕杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的致病机理开展研究，发现毒力岛III型分泌系统基因簇分布在其自身携带的质粒上。25ºC高温培养产生的天然诱变株毒力急剧降低，且质粒上不再携带III 型分泌系统基因簇。诱变株感染的EPC细胞不发生细胞凋亡，诱变株侵袭EPC的能力急剧升高，极显著高于野生型。该诱变株对大菱鲆的毒力急剧降低，预示其可作为弱毒疫苗，通过浸泡途径接种大菱鲆或大西洋鲑等易感鱼类。硬骨鱼的脾脏含有大量的B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，是硬骨鱼类的淋巴器官之一，疫苗接种后脾脏的适应性免疫反应被激活。本项目采用高通量测序的方法，对注射感染杀鲑气单胞菌和注射接种灭活杀鲑气单胞菌疫苗的大菱鲆脾脏组织的表达谱进行分析，发现调控网络中涉及各种免疫相关基因，如NF-κB抑制因子、白介素、紧密连接蛋白、Toll样受体、细胞粘附分子、补体等；亦发现了多种可靶向各种免疫相关基因的miRNA以及这些miRNA靶向的circRNA，并且它们可以通过形成circRNA-miRNA、miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA的调控网络的形式调控免疫相关基因的表达。总之，项目调查了杀鲑气单胞菌在冷水鱼养殖业中的流行和危害情况，建立了该病原的快速检测方法，揭示该病原毒力岛III型分泌系统的致病机理，阐明感染杀鲑气单胞菌或者免疫接种杀鲑气单胞菌灭活疫苗后冷水鱼免疫应答机理，建立了杀鲑气单胞菌的免疫防控技术，使高效监测和预防杀鲑气单胞菌感染成为可能，推动冷水鱼的健康养殖。