暗黑鳃金龟肠道细菌宏基因组及其在纤维素代谢中的功能研究

Lots of research results showed that the gut microbes have been developed a close symbiosis relationship with the insects . As for the insect that could digest and utilize the lignocelluloses, its intestinal commensal microorganisms may be involved in the lignocelluloses degradation and metabolism, and play an important role in the lignocellulose efficient utilization of the insects.Holotrichia parallela Motschulsky is a kind of important agricultual pests, its larval foods contain rich lignocellulose, and hindguts are modified and expanded into a fermentation chamber contained rich bacteria, and call as a potential bioreactor for the lignocelluloses degradation, cellulolytic bacteria were found in its gut. In this propose, Holotrichia parallela is used as the research material, and the metagenomics and metaproteomic technology would be empolied to study the cellulase constitutes and diversity from the intestinal microbe; cellulolytic bacteria would be isolated using microbial techniques;and the roles of cellulolytic bacteria and their cellulase in metabolic behavior of the grub would also be studied using the gnotobiology techniques. In some extent, those study will not only expound cellulolytic mechanism in scarab larvae and functions of gut symbiosis to insects, but also offer enzyme and gene resources for constructing engineering bacteria with high cellulolytic active and developing a new generation of cellulosic biofuel. So this proposal has important scientific significances and practical values.

越来越多研究表明许多昆虫与肠道微生物建立了紧密的共生关系。许多以木质纤维素为食的昆虫，其肠道共生微生物参与了宿主木质纤维素食物的降解及代谢，在昆虫对纤维素高效利用中起着重要作用。暗黑鳃金龟是重要农业害虫，其幼虫食物中含有大量木质纤维素，后肠膨大成富含细菌的发酵腔结构，是纤维素降解的一个潜在反应器，并初步发现其肠道细菌具有较高纤维素分解能力。本研究将以暗黑鳃金龟幼虫（蛴螬）为材料，采用宏基因组和宏蛋白组学技术，研究其肠道微生物源的纤维素酶及其基因组成，分析其参与的纤维素代谢途径，并克隆、表达高活性纤维素酶基因；采用微生物技术分离鉴定肠道纤维素降解菌种类，结合无菌生物学技术研究这些纤维素降解共生菌及其纤维素酶在宿主昆虫纤维素消化代谢中的作用。研究结果对于阐述蛴螬纤维素降解机制和肠道共生细菌对宿主的功能，以及获得新的、高活性纤维素酶基因并应用于生物能源生产，都具有非常重要的科学意义和实践价值。

本研究以暗黑鳃金龟幼虫（蛴螬）为材料，采用宏基因组和宏蛋白组学技术，完成不同种群蛴螬肠道细菌16S rRNA基因克隆文库分析，共构建了10个地理种群蛴螬的肠道微生物克隆文库，分别属于厚壁菌门，变形菌纲，拟杆菌门，放线菌门和梭杆菌门；通过细菌16S rDNA 454测序的方法分析明确不同种群蛴螬肠道细菌群落多样性及群落组成差异。明确暗黑鳃金龟幼虫肠道微生物对宿主生长发育的影响，完成幼虫肠道纤维素酶的酶谱分析，肠道粗酶液中有三条CMC活性条带，通过凝胶活性条带质谱分析获得三种与纤维素降解相关的酶以及部分蛋白序列信息。采用简并引物同源克隆的方法研究了暗黑鳃金龟幼虫肠道微生物源纤维素酶、半纤维素酶基因的组成及多样性，成功克隆了5个糖苷水解酶家族酶基因序列，共包含101个OTUs，GH2、GH8、GH10、GH11及GH36家族中分别有93.94%、10%、52.48%、28.95%以及19.32%的基因片段与已知序列相似性小于80%。说明在暗黑鳃金龟幼虫后肠中富含丰富多样的纤维素酶，半纤维素酶基因，且部分基因序列有着很高的新颖性。筛选获得暗黑鳃金龟幼虫肠道中高产纤维素酶 (HP207) 的菌株和高产木聚糖酶 (HP455) 的菌株，成功克隆了1个内切木聚糖酶和1个β-木糖苷酶编码基因，分别命名为xyn455和xyl455。对xyn455和xyl455酶基因进行原核表达，并进行相关酶学性质分析发现，Xyn455酶不仅可以降解木聚糖类底物，对阿拉伯聚糖类底物也有着一定的降解作用，且Xyl455酶对阿拉伯聚糖也存在着较高的降解活性，酶反应最适pH分别为7.0和6.0，最适反应温度均为40°C。发现新的GH11-7木聚糖酶基因并克隆全长，在蛴螬幼虫肠道纤维素分解菌中筛选出一种含量丰富且与已知酶序列相似性最低的木聚糖酶GH11-7。该木聚糖酶基因片段长335 bp，编码111个氨基酸序列，经BLASTx比对，与来自Aspergillus fumigatus的木聚糖酶基因具有53%的相似性。明确重组xynGH11-7木聚糖酶酶反应最适pH及最适温度。暗黑鳃金龟幼虫肠道纤维素降解菌群的富集继代获得稳定的微生物群落并构建混合菌系，活力高于单一菌株发酵。组合菌株酶活力达到最大约为30℃-35℃，比各菌株酶活力达到最大的温度更温和，更符合生产中生物降解的条件。