苹果低温诱导基因MdCIbHLH1的功能鉴定、翻译后修饰和转基因应用

低温是果树生长发育必需的环境因子，而早春花期前后的异常低温直接影响到果实的产量和品质，但人们果树对低温响应的分子机理和低温响应基因在抗性基因工程中的应用价值知之甚少。在前期工作中，我们从苹果中克隆到一个低温响应基因MdCIbHLH1。在此基础上，本研究将分析该基因在重要农艺性状相关器官中的表达模式和低温响应特性；用该基因在苹果愈伤组织和烟草中的过量表达等来鉴定其生物学功能；然后利用MdCIbHLH1-GFP融合蛋白检测其在低温下的翻译后修饰(磷酸化、泛素化和Sumoylation)，揭示其功能的分子机制；最后获得苹果转基因材料，通过抗性分析评价该基因在低温抗性遗传改良中的应用潜力。通过对MdCIbHLH1基因的上述研究，旨在认识MdCIbHLH1基因在苹果低温信号转导中的生物学功能及其分子机制，获得抗性转基因苹果材料，探讨该基因在苹果抗逆分子育种中的应用价值。

苹果(Malus domestica B.)是世界上栽培最广泛的果树之一，在许多商业苹果栽培地区，低温是限制苹果产量的主要环境因素之一。为了研究苹果低温响应的分子机制，本研究首先筛选到低温响应的bHLH转录因子基因MdCIbHLH1，序列分析表明MdCIbHLH1编码区长1596bp，有3个内含子，编码531个氨基酸，分子量为57.4kD。将MdCIbHLH1与拟南芥bHLH转录因子进行聚类，发现MdCIbHLH1蛋白与ICE1和AtbHLH033紧密聚在一起，基因组结构相似。过半定量RT-PCR分析表明，MdCIbHLH1呈组成型表达，但各组织表达水平不同。在花和幼果等生殖器官中，MdCIbHLH1的表达受低温诱导，同时5个苹果MdCBFs基因也受低温诱导。.拟南芥AtCBF3基因的启动子区域有MYC顺式作用位点，EMSA的结果表明MdCIbHLH1蛋白与AtCBF3启动子的MYC4位点是特异结合的。同时，ChIP-PCR结果表明，MdCIbHLH1蛋白也可以和苹果MdCBF2启动子的MYC顺式作用位点结合。利用农杆菌转化法得到MdCIbHLH1转基因苹果愈伤组织，表达分析结果表明，MdCIbHLH1和MdCBFs在转基因愈伤组织中表达水平提高，同时转基因愈伤组织的抗性提高，MdCIbHLH1通过调控MdCBFs的表达提高抗逆性。为了鉴定MdCIbHLH1基因在植物中的功能，获得了转基因烟草、拟南芥和苹果，转基因材料的抗逆性均得到提高。.另外，利用蛋白杂交技术检测了MdCIbHLH1-GFP蛋白在低温下的表达水平，结果表明，冷处理下MdCIbHLH1蛋白发生降解。为了检测MdCIbHLH1蛋白是否发生泛素化和SUMO化，我们利用anti-GFP抗体免疫沉淀MdCIbHLH1-GFP蛋白，然后用anti-ubiquitin和anti-SUMO抗体进行杂交，结果表明，MdCIbHLH1蛋白在活体条件下能发生泛素和SUMO化蛋白修饰。