乙酰化蛋白Tom1在灰葡萄孢致病过程中的功能分析

Botrytis cinerea can cause grey mold on more than 200 plant species and the financial impact of grey mold is enormous. In addition, control of this disease has become a major challenge due to fungicides resistance. So far, little is known about the function of acetylation in filamentous fungi, previous study has shown that lysine acetylation was involved in virulence of several pathogens. 954 acetylated proteins were identified in our previous work, by gene deletion and phenotypes analysis, Tom1 and acetylated Tom1 have been found involved in the regulation of virulence in B. cinerea. Tom1 was described as a parallel element to ESCRT0 complex in MVB pathway, and so far it has not been reported in pathogens. Based on these preliminary results, we will further explore biological functions of Tom1 and its interaction network through reversed genetics, proteomics and other methods, reveal the role of Tom1 in virulence of B. cinerea. Expected results from this project will be helpful for revealing the role of histone acetylation in virulence of B. cinerea and providing scientific basis for novel drugs development against B. cinerea.

灰葡萄孢寄主范围广（200多种作物）且极易产生抗药性，严重威胁蔬菜水果生产。尽管目前研究较少，但植物病原菌中研究发现蛋白质的乙酰化修饰与其致病性密切相关。因此，项目组前期检测了灰葡萄孢的乙酰化蛋白质组并鉴定到954个乙酰化蛋白。通过对部分候选蛋白进行基因敲除，我们发现Tom1及其乙酰化修饰参与灰葡萄孢致病性的调控，其基因敲除及乙酰化修饰位点的改变都会导致病菌致病力下降。Tom1与MVB途径ESCRT0复合体的功能相似，目前在病原菌中尚无任何研究报道。在此基础上，本项目拟通过反向遗传学、蛋白质组学等手段进一步鉴定乙酰化蛋白Tom1及其乙酰化位点的生物学功能，并阐述Tom1及其互作蛋白在灰葡萄孢致病过程中的功能。本研究结果将有助于进一步阐述灰葡萄孢的致病过程，为丝状真菌乙酰化研究提供线索，并为挖掘潜在的药剂靶标和开发新型杀菌剂提供理论指导。

灰葡萄孢可侵染200多种作物引起灰霉病，在采收前后都可造成严重经济损失。抗药性已使该病害的防治成为蔬菜、水果生产上的一大挑战。蛋白质乙酰化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，目前该修饰在丝状真菌中研究较少。前期乙酰化组的测定我们鉴定到灰霉中954个乙酰化蛋白，其中Tom1与灰葡萄孢致病力密切相关。该基因与MVB途径的ESCRT0复合体的功能相似，目前在病原菌中尚无任何研究报道。本研究发现：.（1）Tom1在110位有一个乙酰化修饰位点；该蛋白的表达量在孢子和萌发阶段较低，菌丝阶段有所上升，侵染阶段（14-24小时）显著上升；.（2）Tom1的敲除突变体及模拟乙酰化修饰Q的点突变对灰葡萄孢的产孢、菌核产生、氧化压力的敏感性及致病力有明显的影响；.（3）酵母双杂交实验证明Tom1可与泛素分子互作，乙酰化位点的突变影响该互作，Tom1的VHS是互作必须功能域。ΔTom1中蛋白泛素化水平显著升高，有358个蛋白的泛素化水平上升1.2倍；.（4）Co-IP验证到Tom1的互作蛋白Per1。该蛋白是一过氧化物酶与致病性密切相关，且该蛋白的泛素化水平在ΔTom1中显著上升，推测为Tom1的下游蛋白。对该蛋白进行研究，发现其为外泌蛋白，基因敲除转化子对氧化压力和致病力都有显著影响。酶活进行测定发现在ΔTom1和ΔTom1-Q点突变中过氧化物酶活显著下降，推测为致病力下降原因；.（5）Co-IP验证到Tom1的乙酰基转移酶Rtt109，二者之间的互作研究正在进行中；.（6）预测互作蛋白Endofin基因敲除后的生长表型、对番茄叶片的侵染能力与敲除突变体ΔTom1基本一致，因此我们认为该基因与Tom1具有相似的功能。但酵母双杂交试验结果表明二者之间并没有互作。.本研究的结果揭示了蛋白乙酰化修饰及Tom1在病菌侵染中的作用，进一步明确灰葡萄孢的致病过程，并为挖掘潜在的药剂靶标和开发新型杀菌剂提供理论指导。