转Bt蛋白基因灰葡萄孢菌构建及对松材线虫毒杀机制研究

松材线虫病(Bursaphelenechus xylophilus)是一世界性的检疫性病害，已经对我国造成了巨大的经济、生态损失，严重影响森林生产和生态安全。申请者前期研究结果显示苏云金杆菌Bacillus thuringiensis ZJFC85的伴胞晶体蛋白对松材线虫毒杀效果明显，确定了其在生物防治松材线虫的潜在价值；克隆获得了该Bt蛋白基因。松材线虫以真菌为食，不同于可以以细菌为食的其他植物病原线虫，加大了深入研究Bt对松材线虫作用的难度。本项目拟在已有研究基础上，以松材线虫的常用培养真菌- - 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)为载体，构建转Bt蛋白基因的灰葡萄孢工程菌株，建立以转基因为手段，以真菌为载体的用于研究毒蛋白作用于松材线虫的研究模型；利用该模型研究Bt蛋白对松材线虫的毒杀机制，为转Bt基因真菌应用于松材线虫病防治提供理论依据。

本项目根据项目实施方案，完成了项目预期研究结果。项目系统分析了浙江天目山土壤中苏云金芽孢杆菌的不同Cry蛋白对松材线虫的毒杀效果，发现了苏云金芽孢杆菌的Cry蛋白对松材线虫作用存在多态性，获得了苏云金芽孢杆菌zjfc85对松材线虫的高效毒杀效果，分离纯化了B. thuringiensis zjfc85的Cry蛋白，测定了该蛋白对松材线虫的剂量效应，浓度为10µg/ml时，致死率达到95.2%；松材线虫在该蛋白的处理下，线虫的虫体表现出不完整，体内的组织也呈现出溢漏的现象，线虫也表现出僵硬，最后死亡。通过基因克隆，获得了一个新的对松材线虫具有明显毒杀效果的基因cry5Ba3。为更好的分析该毒蛋白对松材线虫的毒杀机制，项目完成了人工合成一条适合在真菌中表达的新基因cry5Ba3-1。同时克隆了菌核菌Sclerotinia sclerotiorun的高效启动子，为构建转真菌载体奠定了基础，完成了真菌高效转基因工具载体pCAMBIA-N1的构建。