基于IMC介导/pNP-PEG修饰/肿瘤血管亲和的荷电脂质体及协同靶向NSCLC机理研究

本课题在国家自然基金"酶促甘草次酸磷脂化修饰脂质体及肝靶向定位给药体系研究"及相关课题的研究基础上，提出"将配体介导、亲水基修饰、荷电趋靶性三种不同靶向机理作用在同一载体上，可以实现协同靶向的目的"。采用DC-4-16、HSPC等膜材制备阳离子脂质体，利用pNP-PEG将磷脂极性位点氨基端与IMC-C225抗体进行偶联。一方面在脂质体表面形成密的"构像云"，延长脂质体在血液中的循环时间；另一方面借助抗体与靶细胞表面受体结合，将药物主动介导至病变组织中；同时利用阳离子脂质体与肿瘤新生血管的高亲和力，实现抗肿瘤药物协同靶向亲和定位。本项目制备具有协同靶向的抗体偶联亲水基修饰阳离子脂质体，实现包载药物对NSCLC肿瘤组织趋靶性。本研究包括修饰脂质体设计、分离纯化、体内分布吸收、细胞吸收、膜转运及药效学研究，阐明修饰脂质体协同靶向的机制，为中药抗肿瘤药物的临床应用提供新的技术平台。

本课题首先采用IMC-C225中的胺基与DSPE-PEG2000-NHS中的NHS进行缩合反应制备靶向配体DSPE-PEG2000-IMC，以DSPE-PEG2000和DC-Chol分别为长循环材料和阳离子材料，采用薄膜分散和硫酸铵梯度法制备IMC修饰异长春花碱隐形阳离子脂质体。分别采用马尔文粒度分析仪、TEM和SEM对脂质体的粒径及外观进行了表征，采用葡聚糖凝胶法测定了脂质体的包封率，采用HPLC法考察了脂质体在含药血清中的体外释放度。采用流式细胞仪分别考察了脂质体在小鼠LLT细胞和大鼠VEC细胞中的摄取情况，采用激光共聚焦显微镜法考察了脂质体中的荧光探针与LLT细胞的共定位情况，采用SRB法考察了脂质体对LLT细胞的细胞毒性。以盐酸小檗碱为内标考察了脂质体在SD大鼠中的代谢动力学，采用小动物活体成像法考察了脂质体在荷瘤小鼠中不同时刻的药物组织分布情况。分别以生存曲线、肿瘤体积抑制率、肿瘤重量抑制率和病理切片检查为指标考察了脂质体在荷瘤小鼠中的药效学。结果课题所构建的主动靶向脂质体具有大小合适的粒径(89.65±3.56 nm)、适宜的粒径分布(PDI=0.175±0.01)、稳定的表面电位(35.91±0.51 mV)、较高的药物包封率(90.61±0.80%)以及缓慢的体外释放度(26.74±3.76%)。体外靶向性研究表明主动靶向脂质体可以显著增加荧光探针在LLT细胞和VEC细胞中的分布，LLT肿瘤细胞的细胞毒实验同样验证了相同的结果。动物体内药动学研究表明脂质体经过PEG修饰后t1/2β、AUC(0-48)和AUC(0-∞)分别提高了10.343、5.087和5.882倍，实现了脂质体的长循环作用；荷瘤小鼠的组织分布表明主动靶向脂质体可明显延长包封药物在荷瘤小鼠体内的循环时间和在肿瘤组织中的聚集程度，可以实现不同靶向机理的协同靶向作用。药效学研究表明主动靶向脂质体可以明显延长荷瘤小鼠的生存时间、显著增加肿瘤的抑制率、明显诱导肿瘤细胞的凋亡，同时病理学检识和血相分析表明主动靶向脂质体的毒性较低。同时本课题在完成上述工作的同时，还探索研究了以花生凝集素为靶向配体的主动靶向脂质体和长春花碱亲水基修饰阳离子脂质体。上述各种不同脂质体的研究分别从体外和体内两方面均验证了靶向配体的介导、亲水基修饰及阳离子脂质体的协同增效作用，从而阐述了课题的工作假说的合理性。