利用基于碳点的荧光探针研究钟基因Bmal1与Per1调控黑线仓鼠季节性繁殖的分子机制

Seasonal breeding is an important factor for the fluctuation of rodent population. Clock genes play an important role in this process. Carbon dots is a new fluorescent probe, with good stability, high quantum yield, easy to function and other characteristics. The carbon dots were used as the fluorescent agent to bind the target molecules to construct fluorescent probes that target specific mRNA. Fluorescence distribution and intensity reflect gene expression. Striped hamster (Cricetulus barabensis) is a typical seasonal breeding animal, which is an ideal model for studying seasonal reproduction mechanism and circadian rhythm system. In this study, Bmal1、Per1 and MT1 were specifically labeled by using carbon dots. The expression pattern of Bmal1 and Per1 gene were studied by cell imaging and in vivo imaging， combined with blood hormone concentrations and follicular development data to study the different clock gene expression patterns and tissue-specific. The results may provide a theoretical basis for revealing the molecular mechanism of clock genes regulating of seasonal reproduction of striped hamster, and provide new ideas and methods for the comprehensive management of agricultural rats.

季节性繁殖是影响动物种群数量波动的重要原因，钟基因在动物的季节性繁殖中发挥重要作用。碳点是新型荧光探针，具有稳定性好、量子产率高、易功能化等特性，以碳点为荧光制剂结合靶向分子，构筑可靶向标记钟基因mRNA的荧光探针，通过荧光分布及强度可检测钟基因表达部位及表达量。黑线仓鼠是典型的季节性繁殖动物，是研究季节性繁殖机制的理想模型。本研究通过光周期处理、松果体切除及褪黑激素注射等手段处理黑线仓鼠，利用碳点标记黑线仓鼠钟基因Bmal1、Per1及褪黑激素受体基因MT1，通过细胞成像与活体成像，结合血液激素浓度变化规律及卵泡发育数据，研究不同钟基因表达模式的关联及组织特异性，并揭示钟基因与MT1的关系，以探讨钟基因调控动物季节性繁殖的机制。研究结果可为揭示种群数量波动的分子机制提供科学依据，并为农业害鼠的综合防治提供新思路和方法。

季节性繁殖是影响动物种群数量波动的重要原因，内源性24小时昼夜节律在动物的季节性繁殖中发挥重要作用。黑线仓鼠是典型的季节性繁殖动物，是研究昼夜节律影响动物繁殖机制的理想模型。本研究中，我们采用了计算机辅助的行为学分析，结合分析化学、生理学及分子生物学手段，探究了黑线仓鼠的行为活动、生理指标的节律特征及相关基因的表达模式。碳点是新型荧光探针，具有稳定性好、量子产率高、易功能化等特性，以碳点为荧光制剂，构筑了可靶向钟基因mRNA的荧光探针，通过荧光分布及强度检测了钟基因表达部位及表达量。首先，分别在ZT0，ZT4，ZT8，ZT12，ZT16，ZT20六个时间点，采用睡眠-觉醒、旷场、高架十字迷宫的行为学测试，检测了黑线仓鼠行为的节律性；进一步，采用酶联免疫等方法分别检测了六个时间点黑线仓鼠褪黑激素分泌、血糖浓度及静息代谢率等生理节律；其次，采用基于碳点的荧光探针及荧光定量PCR技术，检测了黑线仓鼠生物钟（Bmal1、Clock、Per1、Per2、Cry1、Cry2）、褪黑激素受体（MT1、MT2、Gpr50）、能量代谢（Sirt1、Fgf21、PPARα）等基因在下丘脑、性腺、肝脏等不同器官的昼夜节律表达模式；最后，研究了不同节律条件下黑线仓鼠主要性器官的形态和功能及RFamide相关肽3（RFRP-3）在下丘脑，卵巢和睾丸中的表达谱。结果表明，黑线仓鼠存在典型的昼夜活动节律性，其静息代谢率存在显著的24 h昼夜余弦节律性（P = 0.001），褪黑激素的分泌存在显著的24 h昼夜余弦节律性（P = 0.040），血糖浓度未表现出显著的24 h昼夜余弦节律性（P = 0.842）。大多数生物钟基因和褪黑激素受体基因在中枢和外周组织均存在显著的24 h余弦节律性，推测生物钟基因对褪黑激素受体基因起调控作用，能量代谢基因仅在肝脏中存在显著的24 h昼夜余弦节律性，推测生物钟基因通过调控肝脏中能量代谢基因进而实现对能量代谢的调控。研究还发现，线粒体裂变参与了不同节律下性器官形态和功能的变化。研究结果为揭示野生动物季节性繁殖机制提供了科学依据，并为农业害鼠的综合防治提供了思路和方法。