SynGAP在PSD-93介导的缺血性脑损伤中作用及其机制研究

In this study, we further investigate the mechanism of postsynaptic density protein-93 (PSD-93) in ischemic brain injury on the based of previous studies. We selected synaptic GTPase-activating protein for Ras (SynGAP) to study through high-throughput comparative proteomic analyses based on isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) using PSD-93 gene knockout mouse and construct middle cerebral artery occlusion (MCAO) model. And in vivo and in vitro, lentiviral expression vector carrying over-expression and silence of SynGAP gene are constructed to analysis the biological expression and functional validation in cerebral ischemia. Furthermore, to explicit the binding domain and amino acid sequence of PSD-93, SynGAP and NR2A, co-immunoprecipitation, laser confocal microscopy mammal double hybrid and gene mutation technology are used. Then the peptide Tat-NR2A and Tat-SynGAP are constructed interfering the binding of the complex to clarify the relationship between PSD-93oSynGAPoNR2A signaling complex and phosphorylation and activity of SynGAP, In this study, we would clarify the binding sites of PSD-93- mediated signaling complex and the effect of it on phosphorylation and activity of SynGAP, Ras-MST1/2-JNK signaling pathway. This study would provide a new signaling transduction pathway and a new target for ischemic stroke.

本项目在既往研究的基础上进一步探讨了PSD-93 在缺血性脑损伤中的作用机制。我们采用PSD-93基因敲除鼠，通过构建小鼠MCAO模型，利用高通量差异蛋白质组学的方法，筛选出目标蛋白SynGAP。通过构建SynGAP过表达和沉默的慢病毒表达载体，在整体动物和细胞水平，对其生物学功能进行验证。并在此基础上，应用免疫共沉淀、激光共聚焦、哺乳动物双杂交及基因突变等分子生物学技术，确定PSD-93与SynGAP、NR2A结合的结构域和氨基酸序列，通过构建Tat-NR2A和Tat-SynGAP干扰PSD-93•SynGAP•NR2A复合物的结合，探讨信号复合物与SynGAP磷酸化和活性的关系，以及对Ras-MST1/2-JNK信号通路的影响。本课题重点探讨了PSD-93介导的信号复合物的结合位点及对SynGAP，Ras活性的影响，阐明了一条新的信号转导通路，为卒中的防治提供新的靶点。

既往的研究发现，PSD-93基因敲除鼠可通过减少NMDAR的激活，进而减少缺血再灌注导致的神经元的损伤。本研究在前期实验基础及蛋白质组学的基础上发现，SynGAP的蛋白表达在野生鼠R4h时明显降低，而其mRNA表达水平无明显变化，且该时间点其泛素化水平明显升高。而缺血前给予蛋白酶体抑制剂MG-132可通过抑制R4h时SynGAP的泛素化进而逆转野生鼠R4h时的SynGAP蛋白表达的降低，最终减轻脑梗死体积，改善野生型鼠神经功能缺损症状。另外，NMDA受体抑制剂MK801可以增加野生型鼠R4h时SynGAP的蛋白表达，而PSD-93-/-缺血前给予NMDA对其R4h时的蛋白表达无明显影响。为进一步明确SynGAP泛素化的机制，我们应用免疫共沉淀、用计算机软件锚定PSD-93和SynGAP结合的可能氨基酸序列，通过构建真核表达的质粒、免疫共沉淀及免疫印迹、基因缺失等方法发现PSD-93(170-190)和SynGAP（670-685）氨基酸序列可能是二者结合的氨基酸序列，通过二者的结合促进了NMDAR的激活，进而促进了自身的泛素化，蛋白质降解，加重了迟发型缺血性脑损伤。遏制SynGAP的泛素化可改善缺血导致的神经功能缺损评分，减少脑梗死体积。本研究团队将在此结果的基础上，设计干扰SynGAP与PSD-93结合的小分子多肽TAT-SynGAP（670-685aa），发现其可通过抑制MST1-JNK信号通路，抑制神经元的凋亡，减轻缺血导致的神经功能的缺损及脑梗死的体积，发挥神经保护作用。本研究将为阐明PSD-93在缺血性脑损伤的中作用机制提供新的视野，为下一步研究小分子药物提供一个新的方向，为临床治疗急性缺血性卒中提供新的依据及靶点药物。