鲸类独特USWS睡眠模式的进化遗传学机制

Sleep, an essential part of the life of vertebrates, is affected by the ecological factors of survival condition in field. In order to adapt completely aquatic environment, cetaceans have evolved an unique form of sleep. Cetacean sleep is characterized by unihemispheric slow wave sleep (USWS), complete absence of rapid eye movement (REM) sleep, and a varying degree of movement during sleep associated with an asymmetrical eye state. However, their genetic and evolutionary bases underlying the USWS are unknown. In this project, we first use comparative genomics and bioinformatics analysis to select a great number of the key candidate genes in regulation of sleep (including neurotransmitter, cytokines, hormone genes as well as molecular clock genes). Then, these key candidate genes will be examined in representative species of major cetacean lineages and compared with corresponding sequences from other mammals to determine its selective pattern during cetacean evolution. Finally, to compare with homologous genes of other marine mammals, we expect to find whether cetaceans and other marine mammals with USWS sleep pattern have parallel or convergent adaptations at molecular level. From all the findings, we expect to illuminate the genetic and evolutionary mechanism of USWS in cetaceans. Thus, we can comprehensively insight into the genetic basis responsible for adaptation to aquatic environment in cetaceans.

睡眠是高等脊椎动物生存的必需条件，受野外生存状态综合因素影响。鲸类为了适应完全的水生生境进化出独特的单半球慢波睡眠（unihemispheric slow-wave sleep，USWS）模式，即一侧大脑半球睡眠而另一侧保持清醒、快速眼动REM睡眠完全缺失、“睁一只眼闭一只眼”并持续游动。然而，鲸类USWS 睡眠模式的遗传学基础尚不清楚。鉴于此，本项目拟通过比较基因组学和生物信息学分析以及文献检索，筛选出一系列在鲸类中受正选择的睡眠调节重要基因；并在鲸类中对受选择的关键睡眠基因进行克隆验证及必要的功能验证，分析鲸类睡眠基因的进化格局；再与具有USWS的其他海洋哺乳动物相比，探讨不同类群间是否存在平行／趋同的USWS分子适应机制。通过本研究，以期系统地揭示鲸类独特USWS睡眠模式的进化遗传学机制，为深入理解鲸类的次生性水生适应提供重要的分子证据。

为适应完全的水生生活，鲸类进化出独特的USWS睡眠。为探讨这一适应性的分子机制，本项目运用进化基因组学方法比较分析了鲸类与陆生哺乳动物以及其他海洋哺乳动物的169个睡眠调控相关基因，并运用进化发育学方法验证了5个重要基因的功能，获得结果如下：1）鲸类增强了核心生物钟基因的调控能力，提高了促觉醒能力，与鲸类USWS睡眠始终一侧大脑半球保持觉醒是一致的。8个核心生物钟基因有6个在鲸类中显著受正选择，且具有41个特异突变。选择了3个关键基因CLOCK、BMAL1和PER3进行体外实验，发现体鲸类特异突变引起亚细胞定位、蛋白质稳定性以及对下游基因激活能力的改变。特别重要的是，将3个基因瞬时过表达到斑马鱼体内，显著引起斑马鱼活动增多，且促睡眠的神经递质显著下调而促觉醒相关基因显著上调。2）在24个促觉醒基因中，鉴定了9个基因的54个位点在鲸类中显著受正选择。特别是，觉醒基因的进化速率与食性和觉醒时长均显著相关，且植食性物种中检测到较多的正选择，为哺乳动物“捕食风险假说”提供了分子证据。3）光信号传导及其调控的生物钟通路协同作用是维持USWS睡眠又一重要机制。在137个光信号传导及其调控的基因中，分别鉴定了10个和73个基因在鲸类谱系中特异受正选择和加速进化，92个基因中具有鲸类特异氨基酸突变。以FBXL3基因进行体外实验，发现鲸类2个特异氨基酸突变（Q223R、T272A）引起蛋白稳定性增加，但泛素化降解CRY1蛋白的能力下降，进而遏制转录因子CLOCK和BMAL1形成的复合物，延长了昼夜节律周期，增加觉醒时间。4）鲸类促睡眠重要激素——褪黑素合成的关键限速酶ANNAT基因失活突变是鲸类适应USWS睡眠的结果。鲸类分泌褪黑素的松果体缺失，且ANNAT基因出现了提前终止密码子（R51X），运用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了鲸源化的转基因小鼠，发现其睡眠显著缩短、睡眠次数和片段化显著减少，与USWS睡眠减少表型一致；转基因小鼠增加了多动、探索、攻击行为而减少了抑郁及焦虑样行为，有助于鲸类维持在水中长时间的觉醒并保持对外界环境的高度警觉。5）具有USWS睡眠的鲸类、海牛和海象三个类群间，鉴定了31个基因中有64个平行／趋同位点，为趋同USWS睡眠模式提供了分子证据。综上，本研究较系统地揭示了鲸类USWS睡眠的进化分子机制。