ClC-7参与牙发生的分子机制研究

During the previous clinical practice, we recruited three osteopetrosis pedigrees caused by the mutations in one of voltage gated chloride channels, ClC-7. We found that the probands had abnormal tooth eruption, rootless, and the different phenotype in incisor and molars. All these changes had a dose-dependent effect between genotype and phenotype. According to our previous chloride channel research data, we hypothesized that ClC-7 plays an important role in tooth development. We will use the following methods, such as siRNA, tooth implantation under kidney capsule, primary culture of dental follicle cells, in vitro induction of ES cells, chitosan modified siRNA and its in vivo injection, CLCN7 RNA splice, in order to test whether the dysfunction of osteoclasts and dental follicle cells caused by the mutations of CLCN7 are the key point to affect tooth erupt pathway and root formation. The changed CLCN7 RNA splice might be the key mechanisms by which dysfunctional CLCN7 occurs, and regulates the variant phenotypes in tissue specific way. We put forward this scientific question based on the clinical findings as well as good preliminary research data. Our results might contribute to finding the new functions of ClC-7 and exploring the mechanisms of tooth eruption and root formation.

在前期临床实践中，我们收集了由于氯离子通道7（ClC-7）基因突变引起的三个骨硬化症家系，观察到三位先证者出现了牙萌出异常、牙根发育不全、前后牙表型不同等特征，同时基因型与临床表型存在剂量效应关系。结合课题组前期氯通道的研究基础，我们提出ClC-7是影响牙发生和牙根发育的重要分子。本项目将通过siRNA、肾被膜下牙胚细胞移植实验、牙囊细胞的体外培养、ES细胞的体外诱导、chitosan修饰siRNA及体内注射、CLCN7 RNA剪接实验等多个实验或方法验证ClC-7通过影响破骨细胞、和/或牙囊细胞的生物学功能，进一步影响牙萌出通道的形成以及牙根的形成，RNA剪接的变化可能是造成CLCN7基因功能变化的核心因素，其组织学的差异性调控也是造成临床表现变化的重要原因。本研究的意义在于结合前期临床发现的问题以及在已有的实验基础提出科学问题，阐述ClC-7新的生物学功能及其致病的机理。

ClC-7 是电压门控氯通道（voltage-gated chloride channel, ClC）家族的一个重要成员，人ClC-7的编码基因是CLCN7，定位于16p13.3，CLCN7 突变可以引起三种类型的骨硬化症，这些类型的骨硬化症患者伴随有不同类型的牙发育异常。本项目通过家系调查、临床样本收集、小鼠体内外实验等，表明ClC-7是参与牙发育、牙萌出和牙根形成的重要分子。临床研究方面，我们先后收集了来自4个家庭的5例骨硬化症患者，临床表现为不同类型的骨硬化症特征，但其均无一例外地伴随牙萌出异常、牙根发育不全等特征，同时基因型与临床表型存在剂量效应关系。随后通过RT-PCR、免疫组织化学染色、原位杂交等多种方法，验证ClC-7在牙胚发育过程中以及牙相关细胞的表达。在Clcn7基因局部敲除实验中，将CS-siRNA-Clcn7纳米粒溶液局部注射于牙胚，通过显微CT和石蜡切片HE染色，观察牙齿发育不同时期，牙胚中各结构，如成釉细胞，成牙本质细胞，牙釉质和牙本质的形成和变化规律，结果发现，不同时间点的实验组表现出异常发育的牙组织、部分区域的牙釉质、牙本质、牙髓已失去正常结构特征以及牙根发育异常；Micro-CT的结果显示实验组小鼠牙不萌出或部分萌出。牙胚经Clcn7 shRNA慢病毒处理，然后行肾被膜下移植，移植后不同时间采用多种方法观察牙的形成和细微结构。石蜡切片H&E染色及AZON染色结果显示，实验组部分前期牙本质变宽，牙根弯曲，牙周组织中正常的牙周韧带、牙骨质及牙槽骨消失，充满了排列紊乱的成纤维细胞，micro-CT扫描结果显示实验组牙畸形，牙根弯曲或变短，牙尖结构不明显。系列体外细胞实验表明：Clcn7 siRNA对体外培养的成釉细胞系和成牙本质细胞系的影响较小，主要表现为对牙囊细胞（DFCs）的影响，如DFCs中ClC-7表达水平的降低导致成骨相关功能分子和RANK-RANKL-OPG信号轴表达水平的改变。DFCs和单核细胞共培养实验，表明DFCs可以促进破骨细胞的分化，降低DFCs的ClC-7表达水平导致破骨细胞数目减少及其骨质吸收功能降低。通过以上综合实验，表明ClC-7通过影响破骨细胞和牙囊细胞的生物学功能，进一步影响牙萌出通道的形成以及牙根的形成。