条件敲除糖皮质激素受体研究应激引起Leydig细胞睾酮合成降低的机制

Chronic stress can result in the decrease of male serum testosterone level in human or animal. The Leydig cell in testis is the major site that generates testosterone in male body. In vivo and in vitro experiments have shown the correlations between increase of glucocorticoid and decrease of testosterone levels as well as the down-regulation of the expression of testosterone biosynthetic enzymes and proteins in the Leydig cell. But it is still unknown whether glucocorticoid is the exclusive or major inhibitor of testosterone synthesis. In this project, we will use Leydig cell conditional glucocorticoid receptor knockout mice to generate stress model to explore the role and mechanism of glucocorticoids. Multi-techniques will be used to examine required parameters. We will use radioimmunoassay or ELISA to measure serum corticosterone and testosterone levels before or after stress, use whole genome profiling to find glucocorticoid receptor-mediated genes. Then, we will use qPCR, Western blotting and immunohistochemistry to validate these important pathways, use enzyme assay to evaluate the activities of some enzymes. Also we will study the role of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2(11βHSD2), a critical enzyme in Leydig cell to eliminate active glucocorticoid.

慢性应激可致男性或雄性动物睾酮水平下降。睾丸Leydig细胞是雄性体内最主要的睾酮合成场所。体内和体外实验均表明糖皮质激素水平升高与睾酮水平下降具有相关性，并与Leydig细胞睾酮合成通路中相关基因下调具有相关性。但暂不清楚糖皮质激素是否是唯一或最主要的抑制因素。本课题采用Leydig细胞条件性糖皮质激素受体敲除小鼠构建慢性应激模型，并与相应野生型小鼠作平行对照，以探究糖皮质激素在其中的作用及机制。实验采用多种技术从不同水平检测相应指标，包括用放免或ELISA法检测皮质酮和睾酮等变化，以高通量基因芯片技术筛查糖皮质激素调控基因，通过生物信息软件分析建立信号网络，归纳出糖皮质激素作用机制。再用qPCR、Western免疫印记和免疫组化等方法验证重要信号通路，用酶学检测相关酶活性变化。同时，探讨Leydig细胞的一个重要糖皮质激素灭活酶11β羟基类固醇脱氢酶2在应激过程中的变化及调节作用。

慢性应激可致男性或雄性动物睾酮水平下降。睾丸Leydig细胞是雄性体内最主要的睾酮合成场所。体内和体外实验均表明糖皮质激素水平升高与睾酮水平下降具有相关性，并与Leydig细胞睾酮合成通路中相关基因下调具有相关性。但并不清楚糖皮质激素是否是唯一或最主要的抑制因素。因此，我们设计了一系列动物试验去论证这个假设，即糖皮质激素是唯一或最主要的抑制因素。. 先利用工具药二甲基硫砜（EDS）对Leydig细胞的特异性“敲除”作用，模拟Leydig细胞的再生和发育过程。通过基因芯片技术，在相应时间点检测Leydig细胞各发育时间基因表达谱特征，我们发现了一些Leydig细胞特有的基因或信号通路。. 然后再构建急性应激大鼠模型，并分离培养大鼠Leydig细胞。发现应激后大鼠皮质醇水平上升而睾酮下降。将细胞培养液中加入LH或/和22R羟基胆固醇后，应激组和对照组Leydig细胞睾酮能力合成都增强，但均不能逆转应激组Leydig细胞睾酮的合成。所以，LH不是引起Leydig细胞睾酮合成下降的主要原因。通过进一步比较应激组和对照组Leydig细胞的一些基因，包括睾酮合成相关基因，发现应激组大量Leydig细胞特有基因发生显著下调。所以，应激时Leydig细胞功能受损可能是应激导致睾酮合成下降的直接原因。应激大鼠使用糖皮质激素受体阻断剂RU486后，其受损的Leydig细胞睾酮合成功能得以逆转。使用糖皮质激素代谢酶HSD11B的调节剂脱氢表雄酮（DHEA）后，应激大鼠的睾酮合成相关基因明显回调或上调。据此可以说明，急性应激导致的Leydig细胞睾酮合成下降的主要间接原因可能是糖皮质激素的过度分泌。. 我们继续使用LC-GRKO小鼠去进一步论证上述结果，但LC-GRKO小鼠繁殖困难，获得的同批小鼠数量有限，这部分实验尚未完成。