基于microRNA负调控途径探讨针刺诱导脑缺血后神经发生机制

针刺治疗中风疗效肯定，系统评价显示在现代康复基础上仍有超过43%的患者可从针刺获益。基础研究表明促进脑神经发生，实现脑功能重组是针刺效应的主要途径之一，而神经发生的microRNA负调控机制是近期研究热点。针刺可能也通过microRNA负调控机制促进脑缺血后神经发生。.本课题在前期研究基础上，以针刺促进脑神经发生为切入点，以microRNA -mRNA -蛋白表达负调控为研究主线，复制经典局灶性脑缺血大鼠模型，研究针刺促进脑缺血后神经发生信息调控机制。首先用免疫组化观察针刺诱导缺血后脑神经发生规律；后以microRNA芯片技术筛选针刺后差异表达谱，用生物信息学预测相关靶基因，再以RT-PCR 和Western Blotting验证靶基因表达，证明针刺通过microRNA负调控机制促进脑神经发生，实现脑功能重组，丰富和完善缺血后 "脑功能重组"学说，并为针刺效应生物学机制研究提供新的科学依据

目的：本课题初步探讨“醒脑开窍”针刺法治疗脑梗死的microRNAs负调控神经发生机制。方法：选取大鼠分成正常组，6h，24h，72h，7d和14d大脑中动脉梗死大鼠模型组，针刺组，假针刺组。部分大鼠取脑分离皮层和海马，用于microRNAs芯片实验，microRNAs的预测靶基因需要同时符合TargetScan、miRanda以及PicTar三款软件的预测标准，同时查询Pubmed数据库；用qPCR技术验证神经发生相关microRNAs和靶基因的表达，用Elisa实验验证靶蛋白的表达。部分大鼠腹腔注射Brdu试剂，取脑后用免疫荧光双染实验来观察针刺后缺血皮质海马中神经细胞再生。结果：本实验发现，模型组在造模6h后即可检测到Brdu阳性细胞，3d时Brdu阳性细胞明显增多，7d时达到高峰，14d时呈下降趋势，但仍有增殖，与既往研究结果一致。而针刺组在6h、24h、72h、7d各组均有个别部位的增殖较模型组增多，证明针刺可以促进内源性神经干细胞的增殖。在皮质中，miR-206-3p、miR-494-3p和miR-214-3p在24h 模型中表达高于正常组。miR-494-3p在针刺24h组表达要低于24h模型组，假针刺24h组表达低于模型组，但比针刺组高。miR-494-3p验证靶基因Nov和DJ-1（促进神经发生）在24h模型组中表达高于正常组，针刺及假针刺24h组中高于模型组。miR-214-3p（促进神经发生）在14d模型组中表达要低于24h模型组，后在14d针刺组中表达上调。miR-214-3p的预测靶基因Acvr1b在24h模型组表达要下调，后在14d组上调，针刺14d组中低于模型14d组。海马中，miR-664-1-5p在24h模型组表达高于正常组，后在24h针刺组表达下调，针刺7d组比模型7d组下调，miR-214-3p在14d模型组中表达要高于正常组及6h模型组。DJ-1在针刺6h组表达要高于模型6h组，miR-664-1-5p的预测靶基因Ccdc101（促进神经发生）在针刺24h 组表达高于模型24h，在7d针刺组表达高于模型7d组。Elisa表明Acvr1b在24h和14d 模型组皮质海马中均上调，针刺和假针刺后，蛋白水平下调，针刺组幅度要高于假针刺组。结论：本课题证明针刺可能通过microRNA负调控途径诱导脑缺血后神经发生来促进脑功能重组。