应用电子顺磁共振技术探究结核分枝杆菌分泌系统内膜蛋白Rv3882c跨膜结构域的结构特征

The ESX-1 secretion system of Mycobacterium tuberculosis serves to secrete proteins, such as virulence factors and survival factors, across its highly hydrophobic and poorly permeable cell envelop, which is crucial for the virulence and survival of Mycobacterium tuberculosis. Therefore, structural investigation on component proteins of ESX-1 secretion system is very important for understanding the infection mechanisms of Mycobacterium tuberculosis. Rv0082c is a very important membrane protein of ESX-1 secretion system and is located on the inner membrane of Mycobacterium tuberculosis. It was predicted that Rv3382c forms a channel-like complex with other proteins and functions to transport the substrates across the mycobacterial cell envelope. However, the structure and function of this protein is still unclear. In this proposal, we are trying to characterize the structure of the transmembrane domain of membrane protein Rv3882c by combing Site Directed Spin Labelling (SDSL) technology and Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy. The acquired mobility, accessibility and orientation information in membrane will be integrated to derive a three dimensional structural model of the transmembrane domain of Rv3882c. Successful implementation of this project will not only yield valuable information for structural determination of Rv3882c, but also provide deeper insights of the protein secretion system and pathogenic mechanism of Mycobacterium tuberculosis. Also, this project will provide method of using EPR as the tool for structural studies of other membrane proteins.

结核分枝杆菌的ESX-1分泌系统能使菌体分泌的致病因子、存活因子等蛋白质穿过其高度疏水致密的细胞被膜，对结核分枝杆菌的毒力和存活极为关键。因此，有关ESX-1分泌系统相关组成蛋白的结构分析对于理解结核杆菌感染机制具有非常重要的意义。Rv3882c蛋白是ESX-1分泌系统中一种重要的内膜蛋白，可能与其他组成蛋白共同形成通道类复合物，负责转运底物穿过细胞被膜，但目前其空间结构和确切的生物学功能尚不明确，仍亟待研究。本项目将结合位点特异性自旋标记与电子顺磁共振技术，通过获取Rv3882c蛋白跨膜结构域的运动性信息、易趋性信息以及在膜环境中的取向信息，综合分析得到Rv3882c蛋白跨膜结构域在膜环境中的三维结构模型。本项目的顺利开展，将为Rv3882c蛋白的结构研究提供重要依据，有助于进一步阐明结核分枝杆菌的分泌系统与致病机制，也为应用电子顺磁共振技术研究其他膜蛋白结构提供方法与思路。

结核分枝杆菌的ESX-1分泌系统能使菌体分泌的致病因子、存活因子等蛋白质穿过其高度疏水致密的细胞被膜，对结核分枝杆菌的毒力和存活极为关键。因此，有关ESX-1分泌系统相关组成蛋白的结构分析对于理解结核杆菌感染机制具有非常重要的意义。Rv3882c蛋白是ESX-1分泌系统中一种重要的内膜蛋白，可能与其他组成蛋白共同形成通道类复合物，负责转运底物穿过细胞被膜，但目前其空间结构和确切的生物学功能尚不明确，仍亟待研究。本项目结合位点特异性自旋标记与电子顺磁共振技术，获取了Rv3882c蛋白跨膜结构域的运动性信息和易趋性信息，结合多种生物物理手段及计算方法，综合得到了Rv3882c蛋白跨膜结构域在生物膜环境中的结构模型。结果表明，该蛋白跨膜区以两个跨膜螺旋方式位于生物膜上，并由一个柔性部分连接，该结果对于阐释结核分枝杆菌分泌系统中重要内膜蛋白Rv3882c的结构特征和潜在功能具有重要意义，同时也为应用电子顺磁共振技术研究其他膜蛋白结构提供方法与思路。另外在本项目开展过程中，应用电子顺磁共振方法结合量化计算方法，研究了酵母呼吸链关键蛋白Ndi1介导电子传递机制，发现该蛋白传导电子是借助自由基对之间的反铁磁相互作用进行，不仅从机理上阐述了Ndi1这一II型复合物I中的一类特殊的电子传递机制，为研发全新的治疗耐药性疟疾的药物提供了精确的结构信息，也为研究和应用生物分子的磁学性质提供了新的思路。另外，还结合位点特异性标记-荧光探针标记-荧光能量共振转移技术，通过荧光寿命变化和各向异性分析研究了植物脱落酸受体PYL10蛋白结合底物时的构象变化，不仅为研究PYL10蛋白与底物相互作用过程提供了重要信息，也为后续研究中进一步将电子顺磁共振方法同荧光方法联用提供了研究基础和思路。