中华猕猴桃果肉色泽相关基因克隆及其定量表达分析

利用抑制消减杂交技术（SSH）和cDNA芯片技术，以黄肉型（代表品种-"金丰"，原产江西省奉新县）和红肉型（代表品种-"红阳"， 原产四川省苍溪县）中华猕猴桃（Actinidia Chinensis Planch.）为研究对象，通过其果实转熟期全黄、全红与全绿期果肉（内果皮）差异表达基因的筛选，从中再筛选出与类胡萝卜素、花青苷等富集相关的基因。然后分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR对其核苷酸及氨基酸序列特征以及所克隆的黄肉与红肉色泽基因cDNA在不同果实发育期间黄肉型与红肉型中华猕猴桃的表达水平进行系统分析，明确类胡萝卜素与花青苷合成相关基因与猕猴桃果肉色泽发育的相关性，从基因的水平阐明中华猕猴桃果肉色泽发育的机制，为猕猴桃分子育种与种质创新奠定良好的基础，对于相关色泽基因在转基因中的利用及其表达的合理调控具有重要的指导意义。

以黄肉型中华猕猴桃‘金丰’为试材，以绿肉猕猴桃为对照，进行果肉色差、叶绿素、类胡萝卜素、类胡萝卜素/叶绿素（比值）、类黄酮、花青苷、糖、酸等生理指标的测定及各生理指标间相关性分析；利用 Illimina/Hisseq 测序技术构建其果实发育中3 个不同转色期DGE文库，以转录组数据为参考数据库，进行GO功能富集以及Pathway功能富集分析。黄肉猕猴桃呈色的关键基因可能存在于具有显著差异表达的12条调控叶绿素合成以及14条调控类胡萝卜素合成的Unigenes之中。通过对其果实着色过程中相关差异基因的表达进行解析，可为分析黄肉猕猴桃‘金丰’在果实发育过程中色泽的变化规律，寻找调控黄肉猕猴桃果实呈色的潜在关键基因，以及探讨猕猴桃果肉呈色机理奠定理论基础。. 基于前期分析测定中华猕猴桃果实发育期间14个不同时期的果肉色素含量，选取8个重要的转色时期提取果肉RNA，应用实时荧光定量 PCR 技术对黄肉型中华猕猴桃‘金丰’果实发育过程中果肉类胡萝卜素合成相关的11个差异基因进行了表达分析，并与各类色素进行相关性分析，所有基因进行聚类分析，综合分析表明，Unigenes11266、Unigenes23885 可能是类胡萝卜素合成的关键基因。利用基因克隆技术对黄肉型中华猕猴桃‘金丰’中编码番茄红素β-环化酶的Unigenes11266 、CL1511、CL10467三个基因进行克隆，并将其分别命名为AcLCYB-1，AcP450-1, AcP450-2，并进行序列分析。. 以‘红阳’ (A. chinesis cv‘Hongyang’)突变体‘HY-09’果实的内果皮和中果皮为试试，探究该突变体在盛花后各个时期色素的动态变化以及糖等变化规律，分析了花青苷与果实色泽之间的关系，并克隆得到了果实花青苷合成途径中转录因子MYB，应用qPCR技术对转录因子MYB以及其他结构基因在果实发育过程中同一果实的内果皮和中果皮进行了表达分析。同时利用PermutMatrix软件对内果皮和中果皮中花青苷合成相关基因在内中果皮和发育时期的差异表达进行双向分层聚类分析，以明晰红肉猕猴桃在果实发育过程中色泽的变化规律，进一步寻找花青苷生物合成过程中的关键基因，并明确花青苷合成相关基因在果实色泽变化过程中的表达模式。