甲基对硫磷降解质粒DNA在自然土壤中的转化规律研究

以恶臭假单胞菌X15的农药(甲基对硫磷)降解质粒DNA为材料,进行卡那霉素抗性基因(Kmr)与绿荧光蛋白(GFP)基因双重标记,提取DNA并制备不同粘粒矿物和腐殖质固定态DNA。先在实验室研究其对几种细菌的转化，分析感受态细胞对DNA吸附特点与转化的关系。然后选取两种土壤，进行施加农药、堆肥和种植小麦处理，基于非培养方法(荧光显微镜与流式细胞仪及DGGE),检测游离和固定态DNA自然转化的频率及转化细菌的多样性。利用激光共聚焦扫描显微镜实时监测不同层次土壤颗粒与根系表面转化细菌的空间分布，通过Real-Time PCR实时监测土壤中质粒DNA的动态变化，以期揭示DNA在自然土壤中的转化规律,阐明自然土壤中影响细菌转化的因素,解析降解农药的细菌基因在土壤中强化的可能途径，为农药污染土壤的生物修复提供科学依据。同时也为深入研究自然土壤中基因的水平转移、土壤细菌的遗传进化及微生物多样性奠定基础。

以高效降解有机磷农药的恶臭假单胞菌B17为材料，将卡那霉素抗性基因(Kmr)与增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）标记于其降解质粒上，获得了带有双重标记的重组质粒rB17。此外，将甲基对硫磷降解基因mpd、Kmr与egfp标记于工程质粒pBHR1和本室分离的抗重金属野生恶臭假单胞菌X4小质粒上，分别获得质粒pBr及pXr。以这三种标记质粒DNA为转化因子，在土壤矿物（蒙脱石、高岭石、针铁矿）的作用下，分别以大肠杆菌DH5α、恶臭假单胞菌KT2440和根瘤农杆菌EHA105为受体菌，进行了实验室转化实验。结果显示，rB17无论是游离态还是固定态都未能获得转化子。pBr能在大肠杆菌及恶臭假单胞菌中转化，其游离态DNA在大肠杆菌中的转化效率为2.98×105个转化子/μg DNA，在恶臭假单胞菌中则为1.05×104个转化子/μg DNA。pXr仅能转化大肠杆菌，但其转化效率最高，为7.27±0.3×105个转化子/μg DNA。同种质粒的固定态DNA都较其游离态DNA转化效率有不同数量级的下降。DNA与G+的枯草芽孢杆菌及G-的恶臭假单胞菌，三种矿物（蒙脱石、高岭石、针铁矿）及其细菌—矿物复合物的等温吸附实验与等温滴定微量热实验结果表明，DNA在细菌、矿物及细菌矿物复合物上的吸附均可用Langmuir方程拟合。DNA在两种细菌表面吸附量相近，枯草芽孢杆菌显著促进了DNA在矿物上的吸附，而恶臭假单胞菌则降低了DNA在高岭石和蒙脱石上的吸附量。DNA在细菌、枯草芽孢杆菌—矿物复合物和恶臭假单胞菌—高岭石复合物上的吸附为放热反应，而DNA在矿物、恶臭假单胞菌—蒙脱石复合物和恶臭假单胞菌—针铁矿复合物上的吸附为吸热反应。选取狮子山土和菜园土，完成了质粒及质粒DNA与蒙脱石、高岭石、针铁矿三种矿物复合物在土壤中的可持续实验。进行了两种质粒在施加农药和堆肥的土壤中的自然转化实验。利用抗生素抗性选择富集或直接用Nycodenz分离菌体后，荧光显微镜镜检及PCR直接扩增标记基因等方法，均未能在土壤中检出阳性转化子。利用分析性流式细胞仪，检测量为5×105，亦未能检出阳性结果。而利用分选型流式细胞仪，进样量达1×108以上，通过抗性及流式荧光分选富集，将样品中的阳性子数量由最初的不足1×10-8提高到近30%。最后通过分选分离及纯化获得了纯培养，经鉴定为肠杆菌科志贺氏菌属及大肠埃希氏菌属。