利用带TAP的BrD家族基因的标签小鼠研究蛋白相互作用组和顺反组

The acetylation of histone lysine is central to providing the dynamic regulation of chromatin-based gene transcription. In cancer, deregulation of acetylation levels results in aberrant expression of growth- as well as survival-promoting genes, but also in downregulation of tumor suppressor genes. The bromodomain (BrD), which is the conserved structural module, is the sole protein domain known to recognize acetyl-lysine residues on proteins. Modulating BrD/acetyl-lysine interactions with small molecules may provide new opportunities for the control of gene expression in human health and disease. In our study, we will generate a new method to system study mouse 40 BrD family protein in vivo/vitro. We will generate tandem affinity purification (TAP)-tagging BrD gene in androgenetic haploid embryonic stem cells (AG-haESCs) using CRISPR/Cas9 technique to establish “artificial sperm” bank carrying TAP-tagging BrD family, and by injection of them into oocytes to establish TAP-tagging ESCs bank and mouse bank. Then using TAP-tag to identify BrD protein expression timing and patterns, also a full interactome and cistrome in ESCs or in vivo. We believe that, from our proposed study, we will characterize the essential molecular events that BrD/acetyl-lysine interactions involve during normal development and disease.

组蛋白乙酰化修饰主要与转录活化相关，调控着整个生命过程，其调节异常与许多疾病的发生发展相关。包含溴结构域（bromodomain，BrD）的蛋白能特异性识别乙酰化的组蛋白赖氨酸，是新一代疾病诊断标志物和药物作用靶点。本项目拟建立一种在体、实时和动态的新型体系，来对小鼠全部40个BrD家族蛋白进行系统性研究，利用CRISPR/Cas9技术在孤雄单倍体胚胎干细胞上进行原位TAP标签打靶，从而获得携带TAP标签的“人造精子”库，进一步通过卵子注射获得ES细胞库和小鼠库，并在ES细胞水平和小鼠生理水平上利用TAP标签对BrD家族蛋白进行表达时间追踪、体内空间位置标记、蛋白相互作用组和顺反组等体内和体外功能研究，从而全方位系统性地揭示BrD家族蛋白通过与组蛋白或非组蛋白的乙酰化赖氨酸修饰相结合，参与调控生命活动中的功能和网络，加深认识生命过程和揭示生命的本质，阐明疾病的发生发展机制与规律。

组蛋白赖氨酸乙酰化修饰主要与转录活化相关，调控着细胞的生存、发育、分化、凋亡和生物体新陈代谢等过程，该修饰的异常与许多疾病的发生发展相关。包含溴结构域（bromodomain，BrD）的蛋白能特异性识别乙酰化的组蛋白赖氨酸，是新一代疾病诊断标志物和药物作用靶点，但大多数BrD蛋白的功能研究并不透彻。本研究对小鼠全部39个BrD家族蛋白进行了系统性分析，利用CRISPR-Cas9技术构建携带HA标签的BrD家族蛋白“人造精子细胞”库，通过卵母细胞注射建立携带HA标签的小鼠胚胎干细胞（mES细胞）库，并利用HA标签对BrD家族蛋白进行表达检测，构建了其中较高表达的30个BrD蛋白的蛋白相互作用组和顺反组。接着通过mES细胞组蛋白ChIP-seq公开数据库，建立隐马尔可夫模型，将基因组划分为12个染色质状态，从而将BrD家族分为四大类，发现第一、二、三类都富集在激活启动子区，对维持mES细胞的基本生理功能发挥着重要作用。其中，第一类主要参与调控mES细胞的多能性，第二类参与调控mES细胞分化信号激活后的三胚层分化，第三类和第四类对于异染色质重建与维持具有重要作用。最后我们描绘了这30个BrD蛋白在行使上述功能过程中的功能蛋白网络。综上，我们第一次系统性地描绘了BrD蛋白家族如何参与调控mES细胞稳态的功能和网络，在维持mES细胞的干性与自我更新的重要作用，促使生命科学研究从传统的单个生物大分子研究模式向规模化、网络化研究转变，对加深认识个体发育的生命过程和揭示生命的本质具有重要的科学意义。另外，基于本项目的成果，我们还启动了基因组标签计划(genome tagging project, GTP)，建立了全新的标签细胞和小鼠战略资源库。