NGDN基因在人白血病细胞中的功能及其作用通路研究

我们先前发现的在人多药耐药白血病细胞系中高表达的功能未知基因AL050003，与之后报道的在鼠神经元中发现的Neuroguidin（NGDN）为同一基因，NGDN可能具有eIF4E结合蛋白、促进细胞周期、维持染色体结构等功能。我们前期研究发现NGDN基因在急性白血病患者中较对照高表达，难治性白血病组较非难治性白血病组高表达，部分患者存在NGDN基因有义点突变。本项目拟进一步扩大病例检测研究，从mRNA表达水平、蛋白表达水平、基因多态性方面分析NGDN基因与急性白血病患者化疗反应的关系，并评估与eIF4E的关系。在体外通过基因辅助技术观察NGDN基因表达变化与人白血病细胞系化疗药物敏感性的关系，与eIF4E、细胞周期调控相关蛋白的关系等；观察化疗药物作用前后NGDN蛋白的亚细胞定位变化；明确NGDN在人白血病细胞中的功能和作用通路。为NGDN及其作用通路成为白血病治疗新靶点提供实验依据。

我们对59例急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia, AML）患者NGDN基因mRNA表达水平分析结果显示，AML患者NGDN基因mRNA高表达组，其骨髓原始细胞比例低（p=0.019），达到CR所需诱导化疗疗程数少（p=0.069），提示NGDN基因高表达可抑制白血病细胞增殖，增加对化疗药物敏感性。我们通过慢病毒转染人髓系白血病细胞系K562及多药耐药细胞亚系K562/A02构建了NGDN过表达的K562-NGDN和K562/A02-NGDN。通过CCK-8法和流式细胞术检测发现不同浓度化疗药物作用不同时间后对K562-NGDN细胞和K562/A02-NGDN细胞的增殖抑制率、诱导凋亡率均较对照细胞显著增加。这些结果表明过表达NGDN基因能增加髓系白血病细胞在体外对常用化疗药物的敏感性。我们利用小RNA干扰K562/A02构建NGDN基因敲除模型（K562/A02-KD），同时以携带无关基因的慢病毒转染获得阴性对照细胞（K562/A02-NC），通过定量RT-PCR芯片方法检测比较其mTOR通路及相关通路基因mRNA的表达水平。其中K562/A02-KD细胞较K562/A02-NC细胞显著高表达的基因包括胞外信号基因、信号传导基因、转录因子基因、细胞侵袭和转移相关基因、细胞骨架基因及癌基因，其中PI3K-Akt-mTOR通路核心蛋白PI3K、PDK1、Akt、mTOR基因在K562/A02-KD细胞中表达上调尤其显著。抑制NGDN基因的表达使得常见肿瘤相关信号通路活化、转录因子及癌基因表达升高，可能促进肿瘤增殖、侵袭及抑制肿瘤凋亡等。我们推断NGDN基因还可负反馈调节mTOR通路。