运用荧光标记重组流感病毒对细胞及体内感染的实时研究

由于缺乏跟踪细胞和动物体内活病毒的技术，有关流感病毒在感染细胞内的复制、转运和包装等生命周期活动的重要信息，人类了解得还很有限。本课题旨在通过构建荧光标记的重组流感病毒（Flu Shanghai Green）,实时研究流感病毒在感染细胞过程中RNP转运、核酸复制及转录、病毒颗粒包装等分子机制，以及病毒在感染小鼠模型中的增殖和扩散活动。1.利用新建立的流感病毒反向遗传学技术，制备整合GFP标记结构蛋白的重组流感病毒，实时分析流感病毒颗粒在感染细胞中的转运过程。2.构建具复制能力的整合Lumio标签标记基因组的重组流感病毒，实时研究病毒的包装过程。3.构建整合荧光素酶的重组流感病毒，利用新兴的体内发光成像技术，确定流感病毒在感染小鼠模型中的分布和扩散。这项研究对于阐明流感病毒在感染细胞和动物体内的复制和包装过程及发病机理有重要的生物学意义，并将提供一种安全有效的研究外源基因转运的病毒载体工具。

本项目研究旨在利用流感病毒反向遗传学操作系统构建整合荧光蛋白的重组流感病毒研究病毒在感染细胞中的实时转运过程；构建具有复制能力整合Lumio标签标记的重组流感病毒以研究病毒在感染细胞中的包装过程；同时计划以生物荧光素酶取代荧光蛋白而构建重组流感病毒研究其在小动物模型感染过程中的扩散和分布。研究中我们尝试了不同的策略以构建具有复制能力的标记流感病毒，结果显示我们能够包装出小肽Lumio标签整合的具有复制能力的重组流感病毒，但是Lumio标签在病毒的复制过程中具有不稳定性。在尝试不同策略构建整合荧光蛋白的重组流感病毒后，我们发现流感病毒基质蛋白（M1）不能整合外源基因而包装出具有稳定复制能力的病毒来。同时我们也尝试了在非结构蛋白基因片段（NS）上插入标记基也未取得具有复制能力的重组流感病毒。在运用流感病毒反向遗传学的过程中，我们发现流感病毒的启动子/复制起点对病毒的复制起了重要作用，U4启动子/复制起点能增强病毒的复制能力；同时我们也发现禽流感病毒PA亚基能够诱导宿主细胞凋亡和产生大量干扰素以抑制病毒的复制。