酿酒酵母的抗逆组学及多重抗逆基因线路的研究

Improving multi-resistance of Saccharomyces cerevisiae to multi-stress including substrate stress, product stress and process disturbance, is of great significance for increasing ethanol yield in bioethanol industry. This program will construct multi-resistant Saccharomyces cerevisiae by inserting resistant gene circuit library into yeast artificial chromosome using Cre-loxP recombination technology. The program aims to solve two scientific issues of “the synergistic, orthogonal and antagonistic effects of resistant gene circuits to several stresses” and “the combination law and principle of multiple resistance gene circuits”. First, we will screen and verify resistant genes from various species, construct resistant gene circuit library, and analyze the synergistic, orthogonal and antagonistic effects of each resistant gene circuit to construct resistome database. Then, we will design different Cre-loxP recombination strategies and optimize the recombination, assemble the resistant gene circuit library into yeast artificial chromosome randomly, and screen the multi-resistant yeasts under various multi-stress conditions. The combination principle of multiple resistance gene circuits in multi-resistant yeasts will be illustrated by genome and transcriptome data. Finally, we will apply the design principle of combinatorial gene circuits to the industrial yeast for bioethanol production, realizing the rational design of multi-resistant strain. As a result, the program will provide new approach and theoretical basis to the construction of multi-resistant chassis cells.

改善酿酒酵母对环境、底物和产物等多重胁迫的多重抗逆性，对于提高生物乙醇发酵产量有重要作用。本项目拟通过Cre-loxP重组的方法实现抗逆基因线路文库在酵母人工染色体中的随机重组，通过筛选得到具有多重抗逆性能的酿酒酵母菌株，拟解决“单个抗逆基因线路对胁迫因素的协同、正交和拮抗作用”和“抗逆基因线路的组合规律和原则”两个关键科学问题。首先，筛选并验证不同来源的抗逆基因，构建抗逆基因线路文库，解析每个抗逆基因线路的协同、正交和拮抗效应，建立抗逆组数据库；然后，设计不同的Cre-loxP重组策略，将抗逆基因线路随机组装到酵母人工染色体，在多重胁迫条件下筛选得到抗逆菌株，通过测序和转录组分析，阐明提高菌株多重抗逆性的基因线路的组合规律和原则；最后，将组合抗逆基因线路的设计原理应用到工业酿酒酵母的改造及乙醇生产，实现菌株多重抗逆性的理性设计。本项目将为构建多重抗逆的微生物底盘细胞提供方法和理论基础。

酿酒酵母是重要的模式工业微生物，常用于燃料乙醇以及其它化合物的工业发酵生产。在工业发酵环境中细胞会面临高温、高乙醇、高乙酸、高糖等胁迫因子的影响，使细胞活性、生长速率和产物的产量降低。若维持稳定的发酵条件，要增加发酵过程控制的成本和能耗。因此，提高酵母菌株的多重抗逆性和鲁棒性是提高酿酒酵母生产效率的根本途径。本项目针对酿酒酵母在工业发酵中面临的多重胁迫因素对酿酒酵母的抗逆性进行改造，并对多重抗逆机理进行分析。首先，筛选了抗逆性强的异源抗逆基因，以酿酒酵母不同强度的组成型启动子和终止子作为调控元件，构建了抗逆标准元件库，用同源重组或SCRaMbLE将基因线路转化至酿酒酵母，筛选出抗逆性能好的基因。然后，验证抗逆基因对胁迫因素的协同、正交或拮抗作用，并且验证了启动子在调控抗逆基因中的正交性和重要影响，通过转录组学发掘了胁迫驱动型启动子，用此类启动子对酿酒酵母的抗氧化途径和乙酸降解途径进行了强化，提高了菌株的鲁棒性和智能性，实现了基因转录水平的智能化反馈调节，并降低了基因表达造成的代谢负担，在高温下工程菌乙醇产量比出发菌株提高了18%。在多基因表达系统中用胁迫诱导型启动子进行调节。进一步，对构建的多重抗逆菌株进行适应性进化，得到一株具有多重抗逆性的工业酿酒酵母菌株，乙醇产率和耐高温性能方面均优于出发菌株，乙醇产量提高了7%，菌株初步应用到企业粮食乙醇的试生产，冷却水的用量及冷却需要的能耗分别比使用出发菌株降低了60.7%和45.1%，每吨玉米原理可以多生产21 kg乙醇，为企业带来巨大的经济收益。最后，对多重抗逆菌株的抗逆机制分析表明，线粒体相关功能基因表达量的上调以及细胞质核糖体基因的表达量下调是细胞耐受性增强的主要原因，并且挖掘到一系列酿酒酵母内源的未知功能的抗逆基因。本研究提高了工业酿酒酵母的多重抗逆性和智能性，有望成为提高工业微生物抗逆性的通用方法和技术。