应用改良染色体构象捕获策略确定HBV增强子在肝癌细胞对宿主基因的调节

HBV是致肝癌发生的重要因素。以往研究偏重于病毒X基因整合到宿主基因组的影响。绝大多数肝癌样品基因组中有HBV增强子Enh1的插入，因此Enh1可能是患者发展为肝癌的重要风险因素。病毒插入位点的随机性和增强子对于靶基因的远端作用是相关研究的最大难点，本课题计划首先应用SOLiD高通量测序对含Enh1的肝细胞癌样品进行测序，将测序结果与人基因组进行比对，确定Enh1的插入位点及频率。随后用改进的染色体构象捕获技术获得增强子与靶基因的全部交联片段，再次通过高通量测序在相应的肝癌样品中确定受到Enh1调节的所有宿主基因，并用定量PCR检测相关基因的表达水平。最后在正常肝细胞中转染含Enh1及其调节的宿主基因，检测转染细胞的形态变化及凋亡情况，并把转染细胞植入裸鼠，分析这些细胞的成瘤性。通过以上分析，本项目可以在一个全新的角度揭示HBV致肝细胞癌的分子机理，为研发新的治疗手段打下重要理论基础。

乙肝病毒（HBV）是导致肝癌的重要因素，随着疾病的进展，HBV病毒DNA片段会整合到宿主基因组上。根据以往研究结果，HBV的增强子在旱獭（woodchuck）的肝癌发生中具有重要作用，并在两个肝癌细胞系的整合HBV片段中发现增强子Enh1的插入（Shamay M et al. Oncogene. 20:6811.），据此我们推测Enh1可能会通过调节宿主基因的表达水平影响肝癌的发生。这一科学假设也是本课题的立项依据。首先，我们利用Alu-PCR方法对36例HBV阳性肝癌样本进行检测，没有发现有Enh1的整合。此外还分析了Sung WK等对81例HBV阳性肝癌样本高通量测序和扩大样本重测序数据（Sung WK, et al. Nat Genet. 44:765），发现只有2例肝癌有增强子序列Enh1的整合（0.5%，2/399），整合率小于1%，远低于前人报道。因此我们推测HBV的增强子在人的肝癌发生中没有明显作用。. 同时上述研究中我们发现与enh1的极低整合相反，病毒的基本核心启动子（basic core promoter, BCP）则高频（46.6%）整合于宿主基因组中。通过生物信息分析还发现BCP区域具有编码microRNA的结构特征。因此，我们及时进行了课题调整，将乙肝病毒编码miRNA的可能性分析验证及其功能初探作为课题在主要研究内容。通过对具有分泌HBV病毒颗粒能力的细胞系HepG2.2.15 microRNA分子的高通量测序，发现HBV的BCP区确实可编码microRNA分子，序列为UGGGUGGCUUUGGGGCAUGG。对此进行了Northern blotting及microRNA的克隆测序，验证可这一miRNA的存在。继而通过荧光素酶报告基因实验发现，该miRNA可以调节TRADD基因的表达，抑制HBV感染细胞的凋亡。这一发现提示一个新的HBV在宿主中存活的策略和机制。. 此外，针对HBV的高突变特性，我们还分析了病毒的突变谱及其突变发生对于病毒序列整合进入宿主基因组的影响。通过对中国北方地区103例HBV患者的51条病毒全序列的突变分析，我们确定了病毒缺失突变的热点区域，并发现这些易缺失的区域也是可被整合入人类基因组的热点区域，且这些缺失与病毒的耐药性相关性不强，与病毒增强子序列的整合一没有显著相关性。