直肠癌肿瘤浸润T细胞受体库的高通量测序研究

T cells recognize antigens by T cell receptors (TCR). Due to genetic recombination of germline cells, the diversity of TCR repertoire is estimated to be more than 10 millions. Recently, high throughput sequencing technique has been applied to sequence millions of TCRs at a single run, which enables us to investigate the global features of immune repertoires. Tumor infiltrating T cell (TIL) is a key player in restrcting tumor growth and in immunotherapy. In this project, we propose to study the diversity of TCR repertoire in colorectal tumors by high throughput sequencing. We aim to identify the tumor antigen specific T cell receptors by selecting highly expressed T cell receptors, based on bioinformatic analysis. By correlating the diversity of TCRs with patients' clinlic outcomes, this study will develop a prognostic tool in the treatment of colorectal cancer and possibly other malignancies.

T细胞受体(TCR)是T细胞表面识别抗原的分子。人体免疫系统具有一个庞大的T细胞受体库，通过VDJ重组，人体的T细胞受体多样性的数目超过一千万。近年来兴起的高通量测序技术可以一次性测出上百万个TCR分子，为全面刻画T细胞受体库特征提供了契机。肿瘤浸润T细胞是抑制肿瘤和过继免疫治疗的的重要免疫效应细胞。本项目拟以直肠癌患者的肿瘤浸润T细胞为研究对象，将采用深度测序方法对人体T细胞受体库多样性进行深入研究。并且结合生物信息学的分析，分离出其中大量表达的T细胞受体，以此来筛选肿瘤抗原特异性T细胞受体。将T细胞受体库的多样性和病人的临床表现进行关联，提出一个临床预测的方法，为免疫特异性治疗提供研究基础。

本项目收集了肾癌的肿瘤组织样本和匹配的外周血样本，分选出肿瘤浸润T细胞，使用多重引物特异性扩增T细胞受体基因，使用高通量测序进行免疫组库测序研究，通过生物信息学方法研究肿瘤浸润T细胞的免疫组库特性。.我们研究得出以下结论：.1．.建立了TCR多重PCR扩增的技术。为了覆盖大部分可能的T细胞受体基因，我们在T细胞受体基因的V区设计了30个引物，在J区设计了13个引物。基于随机标签的多重PCR扩增技术的优势在于解决了当前免疫基因组测序的两大技术难题：引物扩增的不均匀和测序产生的错误。.2．.编写了首个免疫组库自动化生物信息学分析平台，并且上线运行。鉴于国际上对T细胞受体高通量测序的生物信息学工具缺乏的现状，我们开发了一系列软件，可以实现从原始测序数据，到全面分析T细胞受体基因的生物信息学分析。我们开发的软件取名为iRAP （Immune Repertoire Analyzing Pipline），是一个公开的在线服务器。相比起前IMGT-high Vquest和NCBI IgBlast，我们的软件能提供全面的免疫组库分析流程，包括分析TCR组库的多样性和预测TCR组库的大小。.3．.发现了肾癌病人中TCRV2的过度表达。我们发现病人的组织中的高度增值TCR数目和外周血中相似，并未出现明显的TCR 限制性。我们统计了CDR3序列的克隆大小，通过计算每一条CDR3序列出现的频率。发现大部分的CDR3序列只出现一次。我们统计了病人的V基因的使用频率分布，发现TCRV2的使用频率在所有样本中最高。我们统计了病人的CDR3区间的长度分布，发现肿瘤组织和外周血中的长度分布特征非常相似。