苯诱导的PKM2对造血细胞内活性氧代谢的影响和意义

Benzene is an occupational toxicant and an environmental pollutant that induces the production of a large amount of reactive oxygen species (ROS) in target cells such as the hematopoietic stem cells. ROS cause oxidative stress and damages to macromolecules including DNA strand breaks. We have previously found that embryonic hematopoietic stem cells are more sensitive to benzene toxicity compared with adult bone marrow hematopoietic stem cells providing new insights into the mechanism by which benzene induces leukemia in children. Recent studies reveal that certain cancer cells cope with the effect of ROS by inhibiting pyruvate kinase M2(PKM2). Therefore, it is rational to hypothesize that PKM2 plays an important role in determining the biological effects of benzene-induced ROS in hematopoietic cells. This study systematically investigates the effect of PKM2 on the cellular antioxidant response to oxidative stress induced by benzene and metabolites in embryonic hematopoietic stem cells. We will modulate PKM2 activity in the cells by using RNA silencing and PKM2-specific small molecule activators. In vitro colony formation, proliferation of hematopoietic stem cells, and the mRNA and protein expression levels of Nrf2、 GCLM and GSS, which are critical regulators and enzymes in oxidative stress response, will be measured. Cell cycle and apoptosis, ROS, γ-H2AX and PKM2 activities will be examined. The study will reveal new aspects of the mechanism(s) by which benzene exposure causes childhood leukemia and hematopoietic system toxicity.

苯是一种生产性毒物和环境污染物，能够引起靶细胞产生大量的活性氧（ROS），引起氧化应激和大分子损伤，包括DNA双键断裂。本课题组既往研究发现，胚胎造血干细胞对苯毒性的反应较骨髓造血干细胞更为敏感，这为苯致儿童白血病的发病机制的研究提供了新的思路。最近的研究发现，肿瘤细胞通过抑制M2型丙酮酸激酶（PKM2）的活性，来对抗氧化应激和活性氧簇导致的细胞损伤。基于上述发现，我们假设PKM2在苯致造血细胞ROS产生的生物学效应中起着重要作用。本研究着力于PKM2在胚胎造血干细胞对抗苯及其代谢产物氧化反应中的作用。通过RNA沉默技术和特异性小分子激活剂调控PKM2活性，观察造血干细胞生长增殖和体外集落形成情况，检测氧化应激中重要的调节因子和酶如Nrf2、GCLM和GSS的mRNA及蛋白水平的表达，细胞周期和凋亡，ROS，γ-H2AX和PKM2的活性。为苯致儿童白血病和造血系统毒性机制的研究提供新的思路

苯是一种职业性毒物和环境污染物，可以诱导细胞产生活性氧（ROS），引起氧化应激和大分子损伤。本研究探索苯及其代谢产物对造血细胞中ROS和PKM2（M2型丙酮酸激酶）诱导的剂效关系；明确在造血细胞中，苯醌（BQ）对抗氧化系统的作用关系；应用抗氧化剂，通过对PKM2的调控拮抗苯的造血毒性，预防苯中毒。实验中的造血干细胞为小鼠卵黄囊胚胎造血干细胞（YS-HSCs）和骨髓造血干细胞（BM-HSCs）。分离富集YS-HSCs后，用不同浓度BQ处理细胞，DCF-DA染色，流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞中ROS的产生情况；分别用实时定量荧光聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印记法（WB）检测不同浓度BQ处理后YS-HSCs中PKM2 mRNA和蛋白的表达变化情况；分别提取细胞核蛋白和浆蛋白，检测Nrf2的核迁移和蛋白水平的表达变化；用WB检测Nrf2-ARE通路下游的若干蛋白的表达；抗氧化物N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理细胞后检测ROS在调节PKM2蛋白表达水平方面的作用。分离富集BM-HSCs后，用不同浓度BQ处理细胞，运用RT-PCR和WB检测细胞中MST1基因的mRNA和蛋白表达；NAC预处理细胞后用BQ染毒，检测ROS在调节MST1蛋白表达水平的作用。BQ处理YS-HSCs后，细胞内ROS的产生增加，呈剂量反应效应；BQ诱导YS-HSCs中Nrf2的核转移和Nrf2-ARE通路下游蛋白的表达。BQ处理使PKM2蛋白的表达减少，但所有BQ处理组与对照组相比，PKM2 mRNA的表达没有统计学差异，这说明BQ可能诱导了PKM2的降解。抗氧化物NAC预处理细胞使ROS的产生减少，并且抑制了BQ对PKM2蛋白的降解作用。BQ处理BM-HSCs后，随着干预浓度的增加，MST1基因蛋白表达被下调,且以剂量反应形式改变，而其磷酸化水平先升高后降低；NAC预处理后，细胞中ROS的产生减少，NAC抑制了BQ对MST1基因蛋白的下调，磷酸化水平随着NAC浓度增加而降低。该研究首次发现PKM2在YS-HSCs中被BQ诱导降解，同时伴随有细胞内ROS的产生增多；抑制ROS产生后PKM2的降解作用被缓解，证实了ROS在BQ诱导的PKM2降解中的作用。本研究对于探讨苯及其代谢产物对造血细胞内活性氧代谢的影响具有重要的作用，进而可以深入探讨白血病的发病原因和机制。