Surfactin解除芽孢杆菌碳代谢阻遏效应机制的研究

Carbon metabolism is strictly controlled by catabolite control protein A (CcpA) in Bacillus, by which the bacteria preferentially use glucose over other carbon sources. However, little is known about the mechanism for relieving CcpA-depended carbon catabolite repression (CCR) in Bacillus. After deletion of Surfactin synthesis gene srfA, Bacillus amyloliquefaciens could not produce Surfactin to relieve the CCPA-dependent CCR, hence died after glucose exhaustion due to lack of carbon source and energy. We use several techniques including gene knock-out, gene complement, in vitro transcription, reporter gene, and direct interaction between protein and small molecules, to discover the molecular mechanism of Surfactin to relieve the CcpA-dependent CCR in vivo and in vitro. This study will firstly disclose that Surfactin can act as a signal molecule to relieve the CcpA-dependent CCR as well as a linking between quorum sensing and carbon metabolism in Bacillus. Moreover, Surfactin can also be used for the mixed sugars fermentation (e.g. straw hydrolysate) by Bacillus with high efficiency.

碳代谢是微生物的基本代谢，芽孢杆菌的碳代谢受到分解代谢物控制蛋白（CcpA）的严格调控，有葡萄糖存在时CcpA阻遏其它碳源的利用，葡萄糖耗尽后，则可以解除CcpA的阻遏效应利用次要碳源。然而，芽孢杆菌CcpA阻遏效应的解除机制迄今仍未见报道。我们发现解淀粉芽孢杆菌缺乏群体感应分子Surfactin后，就无法解除CcpA的阻遏效应，在葡萄糖耗尽后因不能利用次要碳源而死亡，由此推测Surfactin是解除CcpA阻遏的效应物。本项目拟采用基因敲除与回补、缺失突变体、报告基因、胞外转录、蛋白与小分子相互作用等技术和方法，验证Surfactin是解除CcpA阻遏的活性分子，阐明其解除CcpA阻遏的分子机制，将群体感应和碳代谢紧密联系起来。本项目理论上可填补芽孢杆菌碳代谢阻遏效应解除机制的研究空白，并有助于指导芽孢杆菌的混合糖发酵，为高效利用丰富的生物质资源夯实理论基础。

解淀粉芽孢杆菌WH1可产生多种脂肽类抗生素，具有重要的经济价值和理论研究意义。WH1菌株Surfactin (SFN)脂肽合成基因缺失(△srfA)导致细胞利用次要碳源的能力显著下降，并在对数生长期大量死亡。SFN通过引起细胞膜电位的增强触发下游信号的传递，并需要全局性调控因子Spo0A的参与。回补SFN可恢复△srfA利用次要碳源的能力，但对△spo0A没有效果，表明Spo0A位于SFN信号的下游。在△srfA和△spo0A中敲除ccpA基因，都可在一定程度上缓解碳代谢阻遏效应，恢复菌株利用次要碳源如淀粉的能力。△srfA和△spo0A胞内HPr表达下降，但是CcpA和P~Ser46-HPr的含量无明显变化。△srfA主要碳代谢如EMP、TCA等途径减弱，菌株对某些碳源如柠檬酸、谷氨酸、丙酮酸等利用能力不足。常见的碳源包括偏好的碳源（如葡萄糖、苹果酸等），以及非偏好碳源（如2,3-丁二醇、乳糖等）都能缓解ΔsrfA在对数期的死亡；碳源代谢产生的能量物质ATP和还原物NADH，也可以有效缓解ΔsrfA对数期的死亡。WH1可以合成抑制自身生长的多肽类毒素物质，且SNF缺失后有利于毒素的产生和积累，而葡萄糖等碳源以及NADH等物质，都可以在一定程度上抑制毒素的产生。细胞通过KinB感知SFN信号，启动对该毒素的免疫机制；KinB信号通过激活Spo0A发挥作用，Spo0A既能促进毒素的产生，也能调控细胞对毒素免疫的抗毒机制。.综上所述，SFN作为信号分子可以协调群体感应和碳代谢的调控。与碳源代谢相关的激酶为KinB，需要SNF信号的激活，并通过进一步激活Spo0A而发挥作用。SFN缺失有利于细胞产生的抑制自身生长的毒素的合成与积累，SFN通过KinB调控Spo0A，既调控毒素的合成，也调控对毒素的免疫机制。葡萄糖等碳源则通过产生还原性物质NADH或能量物质ATP，抑制毒素的产生。通过共享信号分子SFN，解淀粉芽孢杆菌将群体感应和碳代谢完美结合起来，共同应对碳源耗尽后营养条件的限制。