重组冠状病毒中外源基因稳定性与TRS核心序列的相关性研究

对于任何活载体表达系统，外源基因的稳定性非常重要。以冠状病毒为骨架构建的表达系统具有很多优点，但外源基因在重组病毒传代过程中容易发生缺失，限制了冠状病毒表达系统的开发和应用。本课题组前期建立了传染性支气管炎冠状病毒的反向遗传操作技术，拯救获得能够表达绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组病毒，研究发现外源基因缺失可能与转录调控序列（TRS）有关。因此本研究以EGFP基因为报告基因，在其TRS核心序列中引入点突变，借助反向遗传操作技术拯救重组病毒，比较不同突变株传代时的遗传稳定性，验证重组病毒中外源基因的稳定性与TRS核心序列之间的相关性。本研究将使我们能够更加深入的了解冠状病毒的不连续转录机制，为建立以冠状病毒为载体的稳定的表达系统提供保障，因此具有重要的理论价值和现实意义。

为验证重组传染性支气管炎病毒（recombinant Infectious Bronchitis Virus, rIBV）中外源基因的稳定性与非经典转录调控序列（Transcription Regulating Sequences, TRS）之间的相关性，项目组借助成熟的IBV反向遗传操作技术，构建并拯救表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因等外源基因的重组传染性支气管炎病毒共13株，通过系统比较这些重组病毒在鸡胚中传代时的遗传稳定性等生物学特性，证实外源基因中存在的非经典转录调控序列与其在rIBV中的遗传稳定性之间没有必然的相关性；以IBV为载体表达的外源基因的遗传稳定性，主要与外源基因本身核苷酸碱基组成的特点有关，将外源基因根据IBV基因组的核苷酸碱基组成特点或密码子偏好性进行重新设计，能够获得具有更高遗传稳定性的重组病毒。本项目按计划完成了所有研究内容，达到了预期的研究目标，为建立以IBV为载体的外源基因表达系统奠定了理论基础。