TRPC6介导的钙紊乱调控肾小管上皮细胞自噬在肾脏纤维化中的作用及机制

Calcium ion (Ca2+) has been adopted as an important signaling molecule and increased Ca2+ entry through the canonical transient receptor potential 6 (TRPC6) channel has been associated with the pathogenesis of glomerular diseases. However, the role of TRPC6 in renal interstitial fibrosis is unknown. Autophagy in tubular epithelial cells (TECs) plays a protective role in renal fibrogenesis by degradation of extracellular matrix(ECM) . Our preliminary data showed elevation of intracellular Ca2+ in primary TECs isolated from mice unilateral ureteral obstruction (UUO) and unilateral ischemia reperfusion injury (UIRI) models. What’ more, pharmacological inhibit function of TRPC6 by administration of BTP2 ameliorated renal fibrosis and possibly through activation of autophagy. So, we hypothesize that activation of TRPC6 in TECs after injury causes increasing levels of intracellular Ca2+ levels , then inhibits autophagy trough PI3K/AKT/mTOR pathway and finally contributes to the pathogenesis of renal fibrosis. In this proposal, we will first examine the role of TRPC6 in UUO, UIRI and 5/6 nephrectomy models. Next, we will further explore the interaction between TRPC6, autophagy and ECM production in TECs both in vivo and in vitro. Finally, we will investigate the correlation between the expression of TRPC6, pathology and clinical outcome in patient with chronic kidney disease. Our study will help to find solutions to prevent development and progression of renal fibrosis.

钙离子(Ca2+)是细胞内重要的第二信使。作为Ca2+内流主要的通道蛋白，经典瞬时感受器电位通道6(TRPC6)在肾脏纤维化中的作用尚不清楚。肾小管上皮细胞(TECs)自噬可降解合成的细胞外基质，发挥肾脏保护作用。我们前期研究发现，小鼠肾脏纤维化模型中TECs出现Ca2+紊乱，药物抑制/基因沉默TRPC6功能/表达能抑制mTOR通路活化，上调自噬水平，进而延缓肾脏纤维化。结果提示TRPC6介导的TECs Ca2+紊乱在肾脏纤维化过程中起重要作用。因此我们提出假说：在致病因素的作用下，TECs Ca2+紊乱，通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制自噬，促进肾脏纤维化的发生。本课题拟从动物、细胞、分子等多层次明确TECs TRPC6介导Ca2+紊乱在肾脏纤维化中的作用，探讨TRPC6对自噬的作用及调控机制，并在慢性肾脏患者进行验证。本项目将为临床防治肾脏纤维化提供理论依据和新的思路。

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各种慢性肾脏病进展至终末期肾病的共同通路和主要的病理表现，表现为大量细胞外基质在肾间质的异常沉积及积聚，导致肾脏功能丧失。肾小管上皮细胞（Tubular Epithelial Cells, TECs）在致病因素的作用下极易受到损害，发生结构及功能的异常，合成、释放大量炎症因子及促纤维化因子，促使肾脏的炎症反应及成纤维细胞的活化。钙离子（Ca2+）是细胞内重要的第二信使，参与了多种生命活动的调节，作为Ca2+内流主要的通道蛋白，经典瞬时感受器电位通道6(TRPC6)介导的Ca2+紊乱参与了多种肾脏疾病的发生发展，但目前的研究主要集中在肾小球病变方面，其对小管间质损伤所致纤维化的作用及调控机制还知之甚少。本研究旨在探讨在致病因素作用下，TECs 是否发生Ca2+紊乱以及TRPC6介导的Ca2+紊乱在肾脏纤维化中的作用及机制。首先，我们分离了梗阻性肾病模型、缺血再灌注模型及马兜铃酸肾病小鼠原代TEC，利用激光共聚焦显微镜动态观察细胞内 Ca2+浓度变化，结果发现，与假手术组相比，模型组小鼠 TECs 内Ca2+浓度显著升高，提示肾脏纤维化过程中，TECs内存在Ca2+紊乱。其次，我们通过免疫荧光及免疫组化染色观察到TRPC6在小鼠慢性肾病模型及CKD患者肾组织中表达增高，且主要分布于肾小管，同时伴随细胞外基质的大量沉积。第三，我们通过药物及基因敲除方法抑制TRPC6后发现小鼠肾间质纤维化程度减轻，同时伴随自噬水平增强；第四，我们利用特异性敲除肾脏近端肾小管上皮细胞 Atg5基因小鼠建立慢性肾脏病模型，同时给予TRPC6抑制剂BTP2，在Atg5-/-小鼠体内，BTP2不能增强自噬水平，进而不能改善肾脏纤维化；第五，我们在体外利用基因转染技术调节HK-2细胞TRPC6表达水平，利用TGF-β刺激细胞，发现抑制TRPC6能增强细胞自噬水平，减少细胞外基质的合成。本课题从动物、细胞、分子等多层次明确了TECs TRPC6介导Ca2+紊乱在肾脏纤维化中的作用，探讨了TRPC6对自噬的作用及调控机制，并在慢性肾脏患者进行验证，为临床防治肾脏纤维化提供理论依据和新的思路。