汉坦病毒包膜糖蛋白与宿主细胞相互作用的新受体研究

我们通过前期实验发现：汉坦病毒感染人胚肺细胞时除通过整合素介导外还存在其他病毒受体。在此基础上，本项目拟采用Biotinylation技术分离得到人胚肺细胞胞膜的表面蛋白组分；同时构建带有标记的汉坦病毒包膜糖蛋白G（G1、G1-G2）的表达载体，体外诱导表达和纯化；然后通过免疫共沉淀方法筛选人胚肺细胞上的病毒新受体；最后应用流式细胞术/免疫荧光技术检测病毒新受体在HV易感细胞上的表达和是否能导致非易感细胞感染，鉴别和确定所得的病毒新受体。该研究将探寻与确定人胚肺细胞上可能存在的HV新受体，从而为深入探讨HV与靶细胞间的相互作用和揭示HV的分子致病机制提供新依据。

目前我国由汉坦病毒（Hantavirus, HV）感染所导致的急性传染性疾病---肾综合征出血热的流行现状依然严峻，但对于其发病机制迄今尚未阐明。已知病毒与宿主细胞膜上特异性受体结合是病毒感染细胞的起始环节，对于病毒能否成功感染具有重要意义。因此，研究病毒特异性受体将有助于阐明病毒的致病机制。现有关于汉坦病毒受体的研究主要集中在细胞膜粘附蛋白β3整合素上，而本课题组前期研究结果显示表皮生长因子受体（EGFR）也参与了HV致病过程，但具体作用机制尚不清楚。为此，我们深入探讨了EGFR在汉坦病毒感染宿主细胞中的具体作用及机制。主要结果：1）采用筛选出的对EGFR表达抑制效率最高的EGFR siRNA作用宿主细胞后再感染汉坦病毒，发现细胞表面EGFR表达量的降低直接导致病毒感染的下降。 2）构建人EGFR的真核表达质粒并稳定转染汉坦病毒非易感细胞，建立了细胞膜上稳定表达EGFR的细胞系CHO-EGFR，再接种病毒后发现非易感细胞获得了对汉坦病毒的易感性，可以被汉坦病毒感染。3）EGFR的配体EGF与汉坦病毒同时作用宿主细胞，EGF与EGFR的结合可使EGFR胞内结构域酪氨酸蛋白激酶活化，从而促进了宿主细胞对HV的摄取，直接导致细胞内病毒核酸水平升高；而EGF预处理宿主细胞致使细胞表面的EGFR发生内化，数量降低，导致病毒感染下降。4）应用不同浓度酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein预处理宿主细胞不同时间后再接种病毒，Genistein可透过细胞膜抑制酪氨.酸蛋白激酶活性，使EGFR内化降低，从而导致病毒感染受阻，且预作用时间越长或浓度越高，病毒感染的阳性率越低，存在明显时间效应和量效关系。本研究明确了EGFR是作为病毒受体参与到汉坦病毒感染宿主细胞过程，这为探讨HV入侵机制和致病机制提供了新的思路，并为抗病毒药物靶点的设计提供重要理论依据。本课题发表相关学术论文2篇，会议摘要2篇，参加国内学术会议交流6次；培养博士生1名、大学生3名。 .