从肺癌cDNA文库中筛选新的肿瘤标志物及其功能研究

肺癌的发病率、致死率居各恶性肿瘤之首，提高肺癌患者生存率的关键在于早期诊治，而目前临床上尚无高敏感性、高特异性的早期诊断技术，寻找提高肺癌有效诊断率的特异性标志物已势在必行。在前期工作中，我们利用噬菌体随机肽库筛选技术已成功筛选出新的特异性结合肺癌相关抗原的亲和性多肽，并以ZS、ZP、ZZ系列多肽命名，那么，与这些多肽特异性结合的肺癌相关抗原是什么？该抗原又可否作为肺癌诊断和靶向治疗的分子标志物？本课题拟在前期大量研究基础上，以"肺癌特异性结合多肽ZS-5"为探针从肺癌cDNA文库筛选出肺癌相关抗原，鉴定该抗原在肺癌组织的检测特异性；采用基因过表达和RNAi技术，研究该蛋白与肺癌细胞生长、转化和凋亡的关系，揭示其在肺癌发生发展中的作用，为肺癌的早期防治提供科学依据。本课题的预期完成可为肺癌早期诊断和靶向治疗提供分子标志物，为肺癌肿瘤疫苗的研制提供候选抗原，具有重要的现实意义。

获得在不同生长周期和多种微环境下的肿瘤细胞中能够长时间高效表达、而在正常细胞低表达或不表达的靶分子是肿瘤诊断和常用药物靶点的重要指标。.本项目应用噬菌体随机肽库技术筛选出一肺癌细胞特异性结合多肽ZS-5后，通过固相化ZS-5对人肺癌cDNA噬菌体展示文库进行3轮减性筛选，发现了与ZS-5结合的肺癌相关抗原GSTA1。采用免疫组织化学技术、细胞免疫荧光技术、Real-time PCR及Western blotting技术证实了GSTA1在肺癌中高表达。激光共聚焦扫描显微镜观察到GSTA1分布在肺癌细胞胞浆和胞膜上。为明确GSTA1表达与肺癌细胞生长的关系，采用基因转染方法双向验证了GSTA1的功能，利用RNA干扰技术和将含有GSTA1的质粒转染肺癌细胞使 GSTA1基因沉默和过表达，MTT法、Hoechest33258细胞核染色法和流式细胞仪检测GSTA1表达对肺癌细胞增殖和调亡的影响，发现了GSTA1过表达会促进肺癌细胞增殖，而GSTA1的沉默会抑制肺癌细胞增殖并诱导其凋亡。分别将已构建好的GSTA1siRNA慢病毒表达载体和GSTA1过表达载体转染至肺癌细胞后，皮下接种于裸鼠左腋下，观察肿瘤生长情况，结果显示GSTA1过表达组裸鼠成瘤能力、肿瘤生长速度、体积和瘤重均高于对照组，而GSTA1siRNA组裸鼠成瘤能力、肿瘤生长速度、体积和瘤重均低于对照组；Western blotting和Real-time PCR结果证实了GSTA1过表达组肿瘤组织中GSTA1的表达明显高于对照组，而GSTA1siRNA组肿瘤组织中GSTA1的表达明显低于对照组。这证实了下调GSTA1的表达可以抑制肺癌的生长，上调GSTA1的表达可以促进肺癌的生长。我们采用MTT法、Hoechest33258细胞核染色法和流式细胞仪双染色法证实了芹菜素能够呈浓度和时间依赖性地抑制肺癌细胞的增殖，并诱导其凋亡。Western blotting 和Real-time PCR检测结果显示芹菜素能够下调GSTA1表达，其对肺癌细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用可能与下调GSTA1的表达有关。综上所述，可见GSTA1在人肺癌的发生与发展中起着重要的促进作用，有望成为肺癌诊断和治疗的新靶点。