膜突蛋白在感染加重ANCA相关性血管炎系统损伤中的机制研究

ANCA associated vasculitis (AASV) received more and more attention because of its poor prognosis. Our previous studies and studies from elsewhere suggested that infection was one of its most important prognostic factors. Further studies suggested that LPS could induce TNF-α secrection by monocytes. Our preliminary study showed that LPS could induce moesin expression in monocytes. To further investigate role of moesin in infection aggravated injury in AASV, we first stimulate monocyte with LPS to study the mechanism of LPS induced moesin expression. We then knockdown moesin expression by siRNA and study the level of TNF-αafter LPS stimulation. We then collect monocyte and neutrophils in patients with AASV and construct MPO-ANCA nephritis mice models to investigate the effects of knockdowning moesin on AASV target organ injuries. Finally, we investigate correlation between moesin antibody titers in AASV patients and clinical parameters as well as histopathological parameters.

ANCA相关性血管炎（AASV）因其起病重、预后差收到重视。我科及国内外研究表明，感染可加重AASV病情，增加死亡率。而感染加重AASV病情可能机制与其诱导单核细胞分泌TNF-α有关。我们前期工作表明，LPS可诱导单个核细胞表达膜突蛋白，且还可在AASV患者外周血中检测到膜突蛋白抗体表达。为进一步研究膜突蛋白在AASV发病中作用，本研究首先在体外研究中，利用LPS刺激单个核细胞，观察LPS诱导单个核细胞表达膜突蛋白机制，并利用质粒转染及siRNA技术，观察敲低其表达后LPS刺激单个核细胞表达炎症因子变化。其次，本研究利用AASV活动期患者外周血单个核细胞、中性粒细胞以及MPO肾炎小鼠模型，观察敲低膜突蛋白表达后对疾病进展影响。最后，我们检测AASV患者外周血膜突蛋白抗体滴度，观察其与疾病活动度及临床病理损伤之间关系。

抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性小血管炎（AAV）是一类以小血管壁炎症坏死为特征，与ANCA密切相关的自身免疫性疾病。其死亡率高、预后差，感染是影响AAV预后最主要因素之一。本课题在前期研究基础上，聚焦于膜突蛋白在感染性炎症加重AAV系统损伤的机制研究。在本研究第一部分，我们利用激光共聚焦显微镜检测发现膜突蛋白在单核细胞表面呈凸起样表达，其在胞内表达与细胞骨架蛋白F-actin部分重合，推测膜突蛋白可能起连接细胞骨架及细胞膜的生物学功能。通过流式细胞仪检测，我们发现LPS可显著促使单核细胞表达膜突蛋白。上述研究表明，感染性炎症可激活单核细胞表达膜突蛋白。在本研究第二部分，我们通过moesin-shRNA、膜突蛋白磷酸化突变质粒，利用质粒转染、RNA干扰、western blot等技术发现MAPK信号通路参与膜突蛋白生物学活性功能，抑制膜突蛋白及其磷酸化修饰可抑制MAPK磷酸化表达，同时也抑制p65 NF-κB表达。上述结果表明，膜突蛋白可通过调控MAPK磷酸化修饰在感染性炎症中发挥其生物学功能，并可能参与调控NF-κB信号通路。同时，利用已成功构建moesin-shRNA，我们通过ELISA等技术发现抑制膜突蛋白表达后可减少炎症状态下中性粒细胞呼吸爆发、减少单核细胞分泌炎症细胞因子等作用。同时我们也发现抑制膜突蛋白表达后，LPS对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表达NO和sICAM-1作用亦被抑制。上述内容提示抑制膜突蛋白后可抑制感染性炎症状态下对中性粒细胞激活、血管内皮细胞损伤的作用。在本研究第三部分，我们首先回顾分析186例AAV患者肾脏病理特点与预后关系，结果表明，肾脏病理分型为“局灶型”患者预后最好，“混合型”预后最差，而“新月体型”和“硬化型”患者预后介于两者之间。利用ELISA、免疫组化等方法表明，AAV患者外周血膜突蛋白抗体滴度较对照组患者高。因此膜突蛋白可作为潜在新的生物标志物在AAV患者中应用，但需进一步大样本临床研究进行验证。综上所述，本研究证实膜突蛋白参与感染性炎症加重AAV系统损伤，可为进一步改善预后提供靶标。