CD123 CAR-T与内皮细胞相互作用模型建立及CLS机制研究

Currently, CD123 is the most interesting target for CAR-T therapy in acute myeloid leukemia (AML). However, CD123 CAR-T causes severe cytokine release syndrome (CRS), capillary leak syndrome (CLS), and even death. Endothelial cell activation and damage in inflammatory states are critical in CRS and CLS, but the current lack of in vitro and in vivo models limits the development of the study. In this project, we constructed an in vitro endothelial CRS model, a contact-endothelium-mononuclear CRS model and a non-contact endothelial-mononuclear CRS model to simulate the CRS status after CAR-T treatment, and to study the release of cytokines and the changes of CD123 levels in endothelial cells. And markers of endothelial cell activation/injury, as well as apoptosis of endothelial cells, changes in NO, eNOS, and NF-κB levels, and further study the molecular mechanism of CD123 CAR-T-damaged endothelial cells and the effect of neutralizing antibody intervention to reduce CD123 The CRS and CLS caused by CAR-T, the safety lays the theoretical foundation.

目前，CD123是CAR-T疗法在急性髓系白血病（AML）中最受关注的靶点。但CD123 CAR-T会导致严重细胞因子释放综合征（CRS）、毛细血管渗漏综合症（CLS），甚至引起死亡。炎症状态下内皮细胞活化及损伤在CRS和CLS中至关重要，但是目前体内外模型的缺乏限制了研究的开展。本项目通过构建体外内皮CRS模型、接触型内皮-单核CRS模型及非接触型内皮-单核CRS模型，从而模拟CAR-T治疗后的CRS状态，研究细胞因子释放水平、内皮细胞CD123水平变化以及内皮细胞活化/损伤的标志物，以及内皮细胞的凋亡，NO，eNOS以及NF-κB水平变化，并进一步研究CD123 CAR-T损伤内皮细胞的分子机制及中和抗体干预效果，为降低CD123 CAR-T所导致的CRS以及CLS，安全性奠定理论基础。

CD123是CAR-T疗法在急性髓系白血病（AML）中最受关注的靶点之一。CD123 CAR-T会导致严重细胞因子释放综合征（CRS）、毛细血管渗漏综合症（CLS）。本研究构建了体外三种研究模型：内皮CRS模型、接触型内皮-单核CRS模型、非接触型内皮-单核CRS模型。比较了三种不同模型中内皮细胞CD123表达、细胞凋亡，细胞因子释放水平、活化/损伤的标志物等水平变化。结果显示，接触型内皮-单核CRS模型和非接触型内皮-单核CRS模型的内皮细胞CD123表达和共培养体系中细胞因子表达明显高于内皮CRS模型，说明共培养体系中单核/巨噬细胞被活化后释放相应细胞因子促进了内皮细胞活化和CD123表达上调。与内皮CRS模型和非接触型内皮-单核CRS模型相比，接触型内皮-单核CRS模型内皮细胞凋亡率显著上调，说明内皮细胞CD123表达上调被CD123 CAR-T识别并进一步杀伤。与内皮CRS模型和非接触型内皮-单核CRS模型相比，接触型内皮-单核CRS模型内皮细胞活化/损伤标志物表达上调，凋亡和内皮活化相关信号通路蛋白表达水平上调，说明内皮细胞被攻击后触发了修复机制PI3K/Akt/eNOS信号通路，同时也激活了Akt/Bax/bcl-2/caspase凋亡途径。因此，在接触型内皮-单核CRS模型中CD123 CAR-T引发了内皮细胞损伤，炎症反应和氧化应激明显增强。利用TNF-α和IFN-γ中和抗体联用阻断内皮细胞CD123上调的干预措施，下调了内皮细胞CD123的表达，缓解内皮细胞损伤程度。因此我们推测，CD123 CAR-T细胞在共培养体系中识别靶抗原阳性的肿瘤细胞，致使CAR-T细胞活化，扩增并释放细胞因子，进一步活化体内单核/巨噬细胞以及内皮细胞并释放相应细胞因子。同时，由于大量IFN-γ、TNF-α作用于内皮细胞使其CD123表达上调，被CD123 CAR-T识别并杀伤，炎症反应和氧化应激明显增强，进一步加重内皮损伤。