PEDV与益生菌黏附模型建立及菌-毒互作分子机制研究

Involved in the enteric virus infection, the bacteria-viral interaction may be an important discovery linkering intestinal microbiota and virus-host interaction field. This is a new field of infectious pathogens, and the related mechanism is still elusive. PEDV is a critical enteric virus to threaten swine breeding in the world. Probiotic is one of top potential anti-infective agent. However, the molecular mechanism of PEDV-probiotic interaction remians unaddressed. Thus, based on the phenomenon that bacteria-viral attachment affect viral infectivity, a series of questions, that "whether probiotic can adhere PEDV, attached virus could keep infectivity, and what the molecular mechanism is", are proposed. Based on previous result that probiotic Lactobacillus plantarum PBioJ-4 characterizes with high adhesivity, we make PBioJ-4 as bacteria model. Sequencing the whole genome, candidate adhesive genes have been excavated by bioinformatics and PCR. Using gene knockout, overexpression, molecular labeling, realtime PCR, confocal microscopy and etc., PEDV-probiotic model is established to explore the relativity between bacteria-viral adherence and viral infectivity. It would reveal the function and mechanism of probiotic in PEDV infection. This would lay the foundation to properly comprehend the bacteria-viral interaction and rational design and development of probiotic product.

菌-毒互作参与肠道病毒感染，是连接肠道菌群和病毒-宿主互作的重要内容，是传染病领域的新课题。流行性腹泻病毒（PEDV）是危害养猪业的重要肠道病毒，而益生菌是最具开发潜力的抗感染制剂，二者互作的分子机制国内外尚未见报道。因此，本研究基于细菌-病毒黏附并影响感染过程的生物现象，以“益生菌能否黏附PEDV？黏附后对感染性有何影响？菌-毒间黏附的具体分子机制是什么？”等科学问题为出发点，立足前期研究基础，以具有高黏附活性的植物乳杆菌PBioJ-4作为细菌模型，经全基因组测序、生物信息学分析及PCR扩增获得侯选黏附基因信息，利用基因敲除、过表达、分子标记、荧光定量PCR、激光共聚焦等技术方法，建立菌-毒互作模型，开展菌-毒黏附对PEDV感染性的影响及其分子机制研究，从而解析益生菌在PEDV感染中的功能及其作用机制，为正确认识菌-毒互作，科学设计开发益生菌提供理论支撑。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是危害生猪养殖的重要传染病，而益生菌作为替抗产品是否同时发挥抗病毒活性仍有待研究。近年，菌-毒互作已经成为研究病毒感染机制的新领域和新课题，尤其如何研究菌毒共存的黏附原理并应用与真实世界，已经成为值得思考的科学问题。因此，本研究通过全基因组测序与生物信息解读，获得候选病毒黏附分子，基于乳酸菌重组表达技术，建立菌-毒互作研究模型，探讨菌毒互作对PEDV的黏附和感染的影响。全域蛋白比对和功能分析筛选到植物乳杆菌中pepN（PN）与PEDV S蛋白受体pAPN具有约33%的氨基酸同源性，但蛋白结构十分相似，分子模拟确认了PN可提供-9.9kcal/mol的结合能，具有作为PEDV受体类似的可能性；而NanT（NT）可作为唾液酸通路中的重要分子，降低乳杆菌表面唾液酸的含量，阻断更多与PEDV S蛋白249/250/457/458位的结合作用。因此，二者都是影响病毒黏附的潜在分子，而PEDV S1区域是两种受体类似物结合的潜在靶点。尽管已经完成表面展示PN重组菌的构建，但唾液酸通路的存在与否更能体现真实的菌毒互作情况。所以，后续研究主要围绕这一事实开展工作。试验结果表明，利用重组乳酸菌技术构建的LP18:NT降低了表面唾液酸含量，导致病毒粒子黏附数量下降，证明了表面唾液酸对病毒黏附的重要性。此外，定量PCR结果证明了菌与PEDV互作4小时时，黏附含量差异最明显，可达5倍以上。这表明PEDV在菌毒互作的过程中可依赖唾液酸发生黏附，而唾液酸通路差异体现了菌株特异性，NT表达能够部分重塑LP18的唾液酸通路降低病毒黏附能力。体外感染实验再次证明，唾液酸分子能够影响PEDV的感染能力，但未能发现其对感染影响的规律。综上，本研究暗示，植物乳杆菌等肠道益生菌可通过唾液酸代谢通路影响PEDV的黏附，而应用黏附作用原理，利用高黏附植物乳杆菌LP18将PEDV疫苗株携带进入动物肠道，可能是一种新型黏膜递送手段。不过，由于没有找到合适的菌毒互作感染体外评估模型，暂时无法判定菌毒互作过程对病毒感染的影响方式和程度。