ANP联合EGCG逆转NPR1基因表达沉默靶向抗胃癌作用及分子机制研究

Currently, clinical metastatic or recurrent gastric cancer patients still lack of effective drug treatment. The development of new efficient anti-gastric cancer drug with low toxicity is of great significance. It has been reported that, atrial natriuretic peptide (ANP) is very safe and has a good anti-cancer effect. The biological function of ANP is mediated by its transmembrane receptor --natriuretic peptide receptor 1 (NPR1). Our previous study found that, NPR1 gene silencing existed in 42.5% of gastric cancer specimen, and gastric cancer cells with NPR1 gene silencing displayed enhanced ability of metastasis and invasiveness. Reversal of NPR1 gene silencing decreased the proliferation and invasiveness of these gastric cancer cells. Therefore, NPR1 may present to be a novel target for the individualized targeted therapy of gastric cancer. Our preliminary experiments found that, epigallocatechin-3-gallate (EGCG) could reversed the silencing of NPR1 expression in gastric cancer cells. We propose that ANP in combination with EGCG can achieve individualized targeted therapy for gastric cancer. In this project, we will firstly clarify the effect of ANP on the biological behavior of gastric cancer cells with normal NPR1 expression. Secondly, we will elucidate the molecular mechanism of how the silencing of NPR1 expression can affect the biological activity of gastric cancer cells. Finally, based on the fact that EGCG can reverse the NPR1 gene silencing, we will study the anti-tumor effect and mechanism of ANP in combination with EGCG on gastric cancer cells with NPR1 gene silencing. This project will lay the foundation for targeted therapy of gastric cancer based on ANP receptor-NPR1.

目前对晚期胃癌患者仍缺乏有效的药物治疗，发展高效低毒的抗胃癌新药意义重大。研究表明，ANP具有良好的抗肿瘤效果，安全性高，其生物活性由NPR1介导。我们前期研究发现，42.5%的胃癌标本存在NPR1基因沉默，此类胃癌细胞的转移能力和侵袭能力明显增强；而逆转胃癌细胞NPR1表达沉默后可使其增值和侵袭能力下降。这提示，NPR1可能成为胃癌治疗的新靶点。我们预实验发现，EGCG可有效逆转NPR1基因沉默。由此我们推测：ANP联合EGCG通过逆转NPR1基因沉默可实现胃癌的个体化靶向治疗。本研究拟首先明确ANP对NPR1正常表达胃癌细胞生物学行为的影响；其次，阐明NPR1表达沉默影响胃癌细胞生物学活性的分子机制；最后，基于EGCG对NPR1基因表达沉默的逆转，研究ANP联合EGCG对NPR1表达沉默胃癌细胞的抗肿瘤作用及机制。通过本课题的实施，将为以ANP受体NPR1为靶点的胃癌基因治疗奠定基础。

目前临床上很多晚期胃癌患者仍缺乏有效的药物治疗，亟需研发高效低毒的抗胃癌新药。心钠素( atrial natriuretic peptide, ANP)是由心房肌细胞产生的内源性小分子多肽激素，由27个氨基酸构成。近期研究表明，ANP除具备调节心血管系统功能外，还具备抗肿瘤作用，安全性高，应用前景非常广泛。但是，ANP是否具有抗胃癌作用？其具体机制如何，迄今为止未见相关报道。. 本项目从如下五方面进行相关研究：①明确NPR1基因是否在细胞增殖、凋亡、转移方面起决定性的作用；②明确ANP是否具有抗胃癌细胞增殖的作用及有效浓度；③明确ANP是否通过NPR-1基因发挥抗胃癌细胞增殖的作用；④ ANP抗胃癌动物模型验证；⑤ANP在其他肿瘤中研究进展追踪。. 本研究到目前为止获得了如下重要研究结果：.①通过qPCR和WB方法对多个胃癌细胞系NPR1的表达检测，确定NPR1在MKN-45中的高表达，本研究结果为后续实验确定实验细胞提供直接依据；.②明确了NPR1基因在胃癌细胞增殖、凋亡、转移方面的作用：通过构建RNAi慢病毒对MKN-45细胞进行NPR1基因敲除（KD组），培养5天后，KD组与对照组对比，KD组凋亡数无明显变化，KD组处于S期和G2/M期的细胞减少(P<0.05)，处于G1期的细胞增加(P<0.05)，同时KD组细胞增殖减缓（P<0.05）。本研究结果表明，NPR1基因主要通过调节细胞周期来抑制胃癌细胞增殖，而对细胞凋亡影响不大。.③ANP在1mmol/L浓度下可显著抑制MKN-45细胞增殖。该结果为我们下一步ANP抗胃癌动物实验提供了直接证据支持。.④ANP与NPR1基因敲除两者对MKN-45细胞增殖的抑制发挥协同作用。本研究结果是我们研究团队的创新性发现，该结果提示ANP的抗胃癌作用除了通过跨膜受体NPR1，还有其他通路。.⑤胃癌CDX/PDX模型建立：为下一步动物实验验证ANP抗胃癌疗效奠定基础。.⑥持续进行ANP抗肿瘤效应文献追踪：我们检索的日本研究者发现术前给予ANP可预防肺癌的术后复发，该研究结果为本研究的科学性、可行性及临床实用性提供了间接证据支持，并对我们下一步研究方向提供了必要的借鉴。