基于恶性婴儿型石骨症诱导多能干细胞模型的破骨细胞功能缺陷机制及基因修复的研究

Infantile malignant osteopetrosis (IMO) is an autosomal recessive disease and could not be curable. The patients' osteoclast activity with IMO is abnormal. The abnormal osteoclast activity is the common pathological feature of osteoporosis, osteolytic tumor and bone metastasis of tumor. Although it was reported that 50 to 60 percent of children with IMO have mutations in the gene TCIRG1, the etiology of the mutant gene is not clear yet. It would not only contribute to cure the IMO, but also contribute to discover the drug for diseases such as osteoporosis to make clear the etiology of the mutant TCIRG1. The applicant has successfully derived IMO patient specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) by extopic expression of cell reprogramming related transcription factors, and plan to do the following research: (1) to induce the IMO-iPSCs to differentiate to osteoclasts, detect the function of the osteoclasts in vivo and in vitro, and discover the pathological feature of the IMO osteoclasts; (2) to study the key mechanism of the IMO abnormal osteoclast activity; (3) to repair the mutant gene with TALENs technology, and study the functional changes of osteoclasts after reparation. Our study would contribute to the establishment of human cell models about diseases, which would be useful for etiology research and drug discovery, and contribute to develop the new strategy of gene therapy and cell transplantation therapy for diseases.

恶性婴儿型石骨症（IMO）是常染色体隐性遗传的破骨细胞活性异常性疾病，无特效疗法。破骨细胞活性异常也是骨质疏松症、溶骨性骨肿瘤及恶性肿瘤骨转移等的共同病理特征。50-60%的IMO与基因TCIRG1突变有关，其导致破骨细胞功能障碍的病因学机制仍未完全明确。厘清IMO病因学机制既利于IMO有效防治，又利于研发抑制破骨细胞药物以直接有效治疗骨质疏松症等疾病。申请人在已建立IMO诱导多能干细胞模型基础上，拟进行：1. 定向诱导破骨细胞分化，在体外和体内检测病变破骨细胞的功能变化，揭示IMO中破骨细胞的病理表型；2. 研究引起IMO破骨细胞功能障碍的关键机制；3.应用TALENs技术，修复IMO-hiPSCs中的病变基因，探索修复前后破骨细胞功能的改变。通过本课题的研究，有助于人类疾病细胞模型建立，为进一步探索疾病的发病机制和药物筛选提供工具，并为疾病的基因治疗和细胞移植治疗提供实验基础和新思路。

课题组成功建立了恶性婴儿型石骨症特异的多能干细胞系（IMO-hiPSCs）体外疾病模型。诱导分化获得破骨细胞，建立IMO的体外研究模型。通过系统的分析IMO病人来源的破骨细胞的分化效率，在体外和体内检测所获破骨细胞的功能，揭示IMO中破骨细胞的病理表型，研究引起IMO破骨细胞功能障碍的关键机制。目前取得的进展如下：.（1）建立了恶性婴儿型石骨症特异的多能干细胞系（IMO-hiPSCs）。细胞能在体外长期扩增，表达多种胚胎干细胞内源性标志基因；体外可形成胚胎体，并表达三胚层的标志物；注射入裸鼠皮下，可形成畸胎瘤；其生物学特性与人胚胎干细胞极其相似。.（2）建立了稳定、高效的多能干细胞定向造血祖细胞的分化体系。通过比较单层诱导法和基质细胞（AGM-S3）共培养法，最终确定使用单层诱导法进行造血祖细胞的分化实验，并最终高效的分化出造血祖细胞。.（3）建立了稳定、高效的造血祖细胞定向巨噬细胞的分化体系。为了得到更纯净的巨噬细胞，我们优化了培养体系，去掉了会影响分选的OP9基质细胞。虽然CD86+CD11b+的巨噬细胞比例降低，但是分选的流程更简单，速度更快，也得到了更多的巨噬细胞。.（4）建立了稳定、高效的巨噬细胞定向破骨细胞的分化体系。.（5）对照组的破骨细胞侵蚀骨片出现蚀骨痕迹，而IMO来源的破骨细胞侵蚀骨片未出现蚀骨痕迹。这充分说明IMO-hiPSCs来源的破骨细胞的破骨能力明显弱于对照组细胞，提示IMO中的病理学机制主要是由于破骨细胞能力衰退造成的。.（6）通过qRT-PCR法定量分析分化破骨细胞酸性组分相关基因的表达情况，包括碳酸酐酶II基因CA2，氯离子通道基因CLCN7，质子泵基因TCIRG1、ATP6V0C、ATP6V1B2、ATP6V0A1、ATP6V1A、ATP6V1E1、ATP6V0D2和Cl-HCO3交换子基因SLC4A8。组织蛋白酶K和基质金属蛋白酶9对骨组织的清除也非常重要，其基因CTSK和MMP9的表达情况也一并检测。结果发现，酸性组分产生和分泌相关基因的表达量的差异都不足以解释IMO-hiPSCs来源的破骨细胞的破骨能力差。这提示其分子机制应该与TCIRG1表达产物结构异常导致的氢离子分泌能力下降密切相关。