基于微孔芯片的高灵敏度肿瘤干细胞蛋白-代谢多组学分析新方法

Cancer stem cells (CSCs) are tumor cells with the ability of self-renewal and drug resistance. They drive the cancer’s initiation, progression, and recurrence. It is important to investigate the biological properties of CSCs for finding the tumor diagnosis targets. The CSCs account for a very small portion (0.01%-2%) in tumor cells, making it a great challenge for detecting using conventional analytical techniques. Recently, single-cell transcriptomics and genomics techniques have been applied for analyzing the cancer stem cells, revealing the role of CSCs in tumor progression. However, the properties and functions of gene-coded proteins and metabolic targets are still unknown. In this contribution, we develop a microwell-based high sensitivity mass spectrometry system for studying the proteins and metabolites in the limited CSCs. Utilizing the microwell as a reaction container we separate the proteins and extract the metabolites based on their polarity and solubility differences with a one-step manipulation. It can significantly reduce the sample loss and enable a simultaneous analysis of metabolites and proteins from one sample. The proposed method will be further applied to explore the self-renewal and differentiation mechanisms of CSCs from multi-omics perspective, providing a foundation for finding the effective tumor diagnosis targets.

肿瘤干细胞推动了肿瘤的发生、发展和复发，具有无限增殖能力和特殊耐药机制，因此对肿瘤干细胞生物特性的深入研究对于寻找新的治疗靶点具有重要意义。肿瘤干细胞所占比例极低（0.01%-2%），对分离检测技术提出极高挑战。目前，单细胞基因组、转录组技术已成功用于肿瘤干细胞研究，初步揭示了其在肿瘤发生发展中的关键作用，但尚无法全面揭示基因编码蛋白的功能，难以对肿瘤治疗靶点中重要的蛋白质和代谢分子开展针对性研究。因此，针对超微量肿瘤干细胞的蛋白组和代谢组联合分析的技术瓶颈和研究空白，本课题提出建立基于微孔芯片的高灵敏度蛋白-代谢多组学分析新方法。以微孔为反应容器，巧妙利用代谢物和蛋白质在极性和溶解度的差异，一步法萃取代谢物并分离蛋白，大幅降低样品损失，实现对同一批肿瘤干细胞中两种生物分子的同步联合表征，有望从多组学角度多维度地解析肿瘤干细胞调节自我更新与分化的分子机制，为其潜在药物靶点筛选提供技术支撑。

近年来单细胞基因组和转录组技术揭示了细胞间的异质性。从多组学水平深度解析细胞异质性对于更好地了解肿瘤转移、细胞耐药性、干细胞分化和胚胎发育等至关重要。然而，与基因组和转录组研究不同，由于缺乏扩增方法和生物分子的多样性，在组学水平对代谢物、蛋白质和翻译后修饰等进行单细胞表征仍然具有挑战性。本研究建立了一种基于微孔芯片的微量样本的代谢组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组多组学同步分析方法。该方法以亲水修饰的芯片微孔为反应容器，基于HILIC分离实现单个细胞的代谢物和蛋白质的串联提取和蛋白质酶解，建立了包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组图谱的数据库，再通过数据非依赖信号采集质谱分析，在无需富集的情况下，解析来自同一样本的代谢组、蛋白组和磷酸化蛋白质组。该方法从单个细胞鉴定132种代谢分子，表征超过1200种蛋白，同时大规模鉴定了磷酸肽和相应高可信度的磷酸位点。该方法成功应用于药物扰动下微量细胞的多组学分析，表征差异化表达的蛋白质和代谢分子，证明了该策略更全面地研究细胞异质性的能力。