蛋白磷酸酶GmHAD1-2与GmCSN5-1互作调控大豆侧根响应低磷胁迫的分子机制

Low phosphate (Pi) fertilizer utilization efficiency is obviously a problem for our agricultural production and development. Root is the major organ for crops to acquire mineral nutrients. Therefore, root traits mainly determine Pi fertilizer acquisition and utilization efficiency. In our previous studies, it was found that suppressed transcripts of GmHAD1-2, encoding a protein phosphatase led to a significant decrease of lateral root growth in the whole-transformation soybean plants. Furthermore, it was found that GmHAD1-2 could interact with GmCSN5-1 through yeast two-hybridization analysis. In the study, their functions in controlling soybean root growth will be further investigated through analyzing transgenic soybean plants with overexpression or suppression of GmHAD1-2 and GmCSN5-1, respectively. Meanwhile, BiFc and pull down analysis will be conducted to investigate the interaction between GmHAD1-2 and GmCSN5-1, combined with analyzing GmCSN5-1 phosphorylation in soybean roots with GmHAD1-2 overexpression or suppression. Furthermore, auxin distribution and expression patterns of its related genes will be examined in lateral roots with GmHAD1-2 overexpression or suppression in order to demonstrate that GmHAD1-2 could regulate soybean lateral root growth and development in responsive to Pi starvation through controlling GmCSN5-1 phosphorylation. The results from the study will not only elucidate the signaling pathway controlled by protein phosphatases in crop Pi signaling network, but also provide genetic resources and candidate genes for developing crop cultivars with high phosphorus efficiency.

作物磷肥利用率低是我国农业生产中的突出问题。根系是作物吸收矿质养分的重要器官，所以根系性状决定了作物对土壤磷吸收利用的效率。我们前期研究结果表明，减少大豆蛋白磷酸酶，GmHAD1-2的表达抑制了大豆整株转基因株系侧根的生长。通过酵母双杂交实验，初步确定了GmHAD1-2与GmCSN5-1存在互作。在此基础上，本项目拟进一步通过对大豆转基因材料的分析，明确超量或抑制GmHAD1-2和GmCSN5-1对大豆根系生长的影响。同时，通过双分子荧光（BiFC）和pull down等技术，结合分析GmHAD1-2抑制或超量表达的大豆转基因材料GmCSN5-1的磷酸化水平、根尖生长素浓度梯度等研究，阐明GmHAD1-2通过调控GmCSN5-1的磷酸化水平控制低磷胁迫下大豆侧根的生长发育。该研究的预期结果可以明确蛋白磷酸酶参与作物磷信号网络建成的途径，而且为培育磷高效的作物品种提供候选基因和遗传材料。

本项目主要围绕“蛋白磷酸酶GmHAD1-2与GmCSN5-1互作调控大豆侧根响应低磷胁迫的分子机制”为重点，按照项目计划，完成了项目的科研任务。取得的主要研究成果包括：1）通过定量PCR分析发现低磷胁迫对加强了GmHAD1-2和GmCSN5-1在大豆不同组织的表达。在此基础上，通过分析GmHAD1-2启动子融合GUS的大豆转基因材料的GUS活性，进一步明确低磷胁迫加强GmHAD1-2在根系，尤其在侧根表达的特性；2）通过酵母双杂和BiFC等研究手段，明确了GmCSN5-1与GmHAD1-2存在互作关系；3）我们获得了超量和抑制GmHAD1-2表达的大豆整株转基因株系。研究结果显示，在正常供磷条件下，相比大豆野生型（WT），GmHAD1-2干涉表达的两个株系侧根长分别减少了60%和32%，磷含量分别减少了41%和33%，揭示了GmHAD1-2参与控制大豆侧根生长的生物学功能；4）通过农杆菌介导的大豆原位毛根转化法，获得了以WT 和抑制GmHAD1-2表达株系 (Ri1) 为背景的生长素报告基因DR5:GUS转基因毛根，分析的结果显示，在侧根发育中，抑制GmHAD1-2表达株系的毛根中GUS的染色显著低于野生型，表明GmHAD1-2参与调控了侧根发育过程中的生长素分布；4）通过RNA-seq分析不同磷条件下WT和Ri1 根系的基因表达谱。结果显示，WT和Ri1根系之间存在726个差异表达基因。其中， 54个差异表达基因与根系发育相关，包括16个转录因子 (如GmZATs)、2个细胞壁扩张蛋白 (GmEXLB1/2)、29个与生长素和乙烯信号通路相关的基因。这些研究结果表明GmHAD1-2可以通过影响根系发育相关基因，尤其是生长素相关基因来调控侧根响应低磷胁迫；5）比较超量表达GmCSN5-1转基因拟南芥 (OX1/2) 和野生型 (WT) 在不同磷处理下的生长情况。结果显示，在低磷条件下，超量表达GmCSN5-1转基因拟南芥两个株系的根部鲜重均显著高于WT。总之，通过以上的研究，阐明GmHAD1-2通过与GmCSN5-1互作，从而参与调控大豆侧根的生长发育，为进一步培育磷高效的作物品种提供候选基因和遗传材料。在项目实施期间，标注该项目发表的SCI收录论文8篇，培养了2名硕士研究生毕业、3名博士毕业生和1名博士后，获得国家发明专利授权3份。