GmNEF1调控大豆根瘤响应低磷胁迫的生理和分子机制

Phosphorus application facilitating nitrogen efficiency improvement is a technique of high-yield cultivation in legume crops. Phosphorus is directly involved in nitrogen fixation in nodules. However, physiological and molecular mechanisms underlying the process remain largely unknown. In our previous study, we have cloned a phosphate starvation induced and nodule specific gene, GmNEF1. Overexpressing GmNEF1 led to improving phosphorus and nitrogen content, as well as nodulation in soybean hairy roots. Furthermore, expression levels of some phosphate starvation responsive genes (e.g., GmPT5) were regulated by GmNEF1 in nodules, suggesting that GmNEF1 is directly involved in nodule adaptation to phosphorus deficiency. In the present study, we intend to obtain the stable genetic transgenic soybean plants with overexpressing or suppressing GmNEF1. Then, the transcriptomes of wild type and transgenic nodules will be investigated and compared via RAN-sequence; Using the yeast two-hybrid technique, the protein interacted with GmNEF1 will be identified and functionally analyzed. All the results together will demonstrate the phosphate responsive network as regulated by GmNEF1 in soybean nodules, result in further understandings of the mechanisms underlying phosphorus application facilitating nitrogen efficiency improvement, provide theoretic basis and germplasm for developing both phosphorus and nitrogen efficient soybean varieties through genetic breeding.

"以磷增氮"是豆科作物传统的高产栽培措施之一。磷直接参与调控根瘤固氮过程，但其内在的生理及分子调控机制尚未清楚。我们前期克隆了一个大豆根瘤特异、受低磷诱导表达的基因，GmNEF1。在大豆毛根中超量表达GmNEF1显著改善了大豆氮磷营养及结瘤状况，调控了大豆根瘤中部分磷饥饿响应基因的表达（如GmPT5等），暗示GmNEF1参与调控了根瘤对低磷胁迫的适应性。本研究拟获得超量或抑制GmNEF1表达的、稳定遗传的大豆整株转基因材料，通过RNA-seq技术，对转基因和野生型大豆根瘤基因表达谱进行比较分析；结合酵母双杂交技术，鉴定GmNEF1的互作蛋白并进行功能分析。以期明确GmNEF1调控根瘤响应低磷胁迫的分子调控网络，加强对豆科作物"以磷增氮"调控机制的理解，为进行大豆氮磷协同高效遗传改良提供理论依据和种质资源。

本项目以明确在大豆根瘤中对低磷胁迫响应的GmNEF1（即GmSPX5）的功能为研究主线，开展了相关的植物营养生理和分子生物学的研究，取得的主要研究成果包括：1）分析了低磷胁迫对大豆GmNEF（即GmSPX）家族9个成员在大豆不同组织的表达模式。在此基础上，以在根瘤受低磷胁迫加强表达的GmNEF1（即GmSPX5）为研究对象，开展了进一步的功能研究；2）通过烟草瞬间表达体系明确了GmNEF1在细胞核和细胞质双定位的特性；3）通过分析GmNEF1启动子融合GUS的大豆转基因材料根瘤切片的GUS活性，明确了GmNEF1在根瘤皮层细胞和固氮区域高度表达的组织表达特性；4）对超量和抑制GmNEF1表达的、稳定遗传的大豆转基因后代进行分析，结果发现超量表达GmNEF1显著促进了大豆根瘤的生长及其大豆氮磷吸收量。而且，在田间试验中，在减少氮肥使用量50%的前提下，配合接种高效根瘤菌，两个超量表达GmNEF1转基因株系的单株籽粒数量和干重均比野生型增加20%以上；5）通过RNA-seq比较了野生型和超量表达GmNEF1株系根瘤的表达谱，发现超量表达GmNEF1显著影响了155个基因的表达。GO分析表明这些基因主要参与了根瘤的氨基酸代谢和脂代谢等代谢过程；6）以GmNEF1-BD为诱饵，通过酵母cDNA文库的筛选和酵母双杂交实验，确定了8个蛋白与GmNEF1存在互作，包括NF-Y转录因子、茉莉酸信号相关蛋白、LEA蛋白、碳酸酐酶、糖苷水解酶、蛋白酶抑制子、植物分泌蛋白和ACT结构域蛋白等。总之，通过以上的研究，明确了GmNEF1通过影响下游基因的表达或互作蛋白的功能，主要调控了大豆根瘤的氨基酸代谢和脂代谢等过程，加强大豆根瘤对低磷胁迫适应，达到大豆氮磷协同高效的机制。这为遗传改良豆科作物氮磷协同高效的研究提供候选基因和遗传材料。在项目实施期间，标注该项目发表的SCI收录论文3篇（累积SCI影响因子14）、参编1部外文书籍，培养了4名硕士研究生毕业和2名博士后，获得国家发明专利授权3份。